Dermanên kêzikan roleke girîng di çareserkirina kêmbûna xwarinê ya cîhanî û têkoşîna li dijî nexweşiyên mirovan ên bi rêya vektoran ve têne veguhastin de dilîzin. Lêbelê, pirsgirêka mezinbûna berxwedana dermanan bi lezgînî hewce dike ku pêkhateyên nû werin kifşkirin ku hedefên kêm-bikaranîn hedef digirin. Kanalên potansiyela wergirê demkî ya kêzikan (TRPV) - Nanzhong (Nan) û neçalak (Iav) - dikarin kanalên heterolog (Nan-Iav) çêbikin û li organên mekanosensor ên ku navbeynkariya jeotropîzmê, bihîstinê û proprioceptionê di kêzikan de dikin bicîh bibin. Hin dermanên kêzikan, wekî aphidopyrrolidone (AP), Nan-Iav bi mekanîzmayên nenas hedef digirin. AP li dijî kêzikên qul-mijok (hemipterans) bi bandor e, û bi têkbirina fonksiyona fîlamentan pêşî li xwarinê digire. AP tenê dikare bi Nan ve girêbide, lê tenê Nan-Iav dikare bi agonîstan re, di nav de nîkotînamîda endojîn (NAM) re têkilî dayne, bi vî rengî çalakiya kanalê nîşan bide. Tevî potansiyela Nan-Iav wekî hedefek dermanek kêzikan, di derbarê civîna kanala wê, cihên girêdana rêziknameyî, û rêziknameya girêdayî Ca2+ de hindik tê zanîn, ku pêşveçûna bêtir a dermanan asteng dike. Di vê lêkolînê de, mîkroskopiya krîo-elektronî ji bo destnîşankirina avahiya Nan-Iav di kêzikên Hemiptera de di rewşa bê lîgand-kalmodulîn de, û her weha bi AP û NAM re li sînorê domaina sîtoplazmayî ya dubarekirina ankîrîn (ARD) hate bikar anîn. Bi awayekî ecêb, me dît ku proteîna Nan bi xwe dikare pentamerek çêbike, ku bi têkiliyên ARD-ê yên bi navbeynkariya AP-ê ve tê stabîl kirin. Ev lêkolîn têkiliyên molekulî yên di navbera însektîsîd û agonîstan û Nan-Iav de eşkere dike, girîngiya ARD di fonksiyon û kombûna kanalê de destnîşan dike, û mekanîzmaya rêkxistina Ca2+ vedikole.
Li hember rewşa guherîna avhewayê ya gerdûnî ya ku her ku diçe girantir dibe, xirabûna ewlehiya xwarinê ya gerdûnî yek ji pirsgirêkên sereke yên sedsala 21-an e, ku encamên wê yên neyînî ji bo civakê hene.1,2Rapora Rêxistina Tenduristiyê ya Cîhanê ya bi navê Rewşa Ewlehiya Xwarin û Xurekê li Cîhanê ya 2023an (SOFI) texmîn dike ku li çaraliyê cîhanê nêzîkî 2.33 milyar mirov ji bêewlehiya xwarinê ya navîn heta giran dikişînin, ku pirsgirêkek demdirêj e.3,4Mixabin, tê texmînkirin ku salane %20 heta %30 an jî zêdetir ji berhemên çandiniyê ji ber kêzikan û nexweşiyan winda dibin, û tê payîn ku germbûna gerdûnî berxwedana li hember kêzikan û lawazbûna çandiniyê zêde bike.4,5,6,7,8Pêşxistina dermanên kêzikan ne tenê ji bo parastina berhemên çandiniyê ji kêzikan û kêmkirina belavbûna patojenên ku bi rêya vektoran têne veguhestin girîng e, lê di heman demê de ji bo têkoşîna li dijî nexweşiyên mirovan ên ku bi rêya vektoran têne veguhestin ên wekî tayê dengu, malarya û nexweşiya Chagas, ku her ku diçe li hember dermanên kêzikan berxwedêr dibin jî girîng e.5,9,10,11
Di nav hedefên sereke yên kêzikên neurotoksîk de, kanala heterotetramerîk a TRPV Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) komek hedefên kêzikan temsîl dike ku tenê di deh salên dawî de hatine keşifkirin, di nav de kêzikên bazirganî yên wekî imidacloprid û pyraclostrobin jî hene.12,13,14Kêşkêşkêşa nîv-sentetîk aphidopyrrolifen (AP) berhemeke ku vê dawiyê hatiye pêşxistin û bazirganîkirin e û hêmana wê ya sereke kêşkêşa çalak Inscalis® e, ku bi AP-yê re di asta çalakiya subnanomolar de girêdide.15AP ji bo tozkeran, kêzikên sûdmend û organîzmayên din ên ne-armanc jehrîbûna tûj a kêm nîşan dide, û dema ku li gorî rêwerzên etîketê were bikar anîn, ew dikare zexta berxwedanê ya li hember kêzikên din kêm bike.16,17,18Nan û Iav li seranserê cureyên kêzikan bi berfirehî belav bûne, tenê di neuronên wergirên dirêjkirina akordal ên anten û lingan de bi hev re têne îfade kirin, û ji bo bihîstin, têgihîştina gravîtasyonê û proprioception girîng in.13,16,19,20,21,22AP, imidacloprid, û pyraclostrobin bi rêya mekanîzmayeke bêhempa kompleksa Nan-Iav teşwîq dikin, û di dawiyê de veguhestina sînyala proprioceptive asteng dikin.13,16,23Di kêzikên qulker-mijok (hemipteran) ên wek kêzikên sipî û mêşhingivên spî de, windakirina proprioceptionê şiyana wan a xwarinê kêm dike, û di dawiyê de dibe sedema mirinê.13,24Balkêş e ku AP ji bo kompleksa Nan-Iav eleqeyek bilind û ji bo Nan bi tena serê xwe eleqeyek kêm nîşan dide. Girêdana AP bi Nan-Iav re ceryana elektrîkê çêdike, lê girêdana bi Nan bi tena serê xwe çalakiya kanalê teşwîq nake. Iav bi xwe qet bi AP ve nayê girêdan.16Ev yek nîşan dide ku Nan û Iav dikarin bi hev ve girêbidin da ku kompleksên kanala Nan-Iav yên cûda çêbikin (mînak, bi rêjeyên stoikyometrîk ên cûda an rêzikên cûda di heman rêjeya stoikyometrîk de) an jî ku AP dikare bi gelek cihan ve girêbide. Wekî din, nîkotînamîda agonîst a xwezayî (NAM) bi girêdana mîkromolar bi Drosophila Nan-Iav ve girêdide, bandorên dişibin yên kêzikên sor (AP) di vitro de nîşan dide.16,25û astengkirina zêdebûn û xwarina kêzikên sor, ku di dawiyê de dibe sedema mirina wan25,26Ev dane gelek pirsan derdixin holê. Bo nimûne, hîn ne diyar e ka heterodîmera Nan-Iav çawa çêdibe, kîjan cihên girêdanê ji bo modulkirina molekulên piçûk têne bikar anîn, û ev molekulên piçûk çawa fonksiyona kanalê bi tepeserkirina propriosepsiyonê rêk dixin. Wekî din, sedemên ku Nan bi xwe neçalak e û ji bo AP-ê eleqeyek kêm heye, lê heterodîmera Nan-Iav çalak e û bi eleqeyek bilindtir bi AP-ê ve girêdide, hîn ne diyar in. Di dawiyê de, di derbarê rêziknameya girêdayî Ca2+ ya fonksiyona Nan-Iav û ka ew çawa di pêvajoyên sînyala neuronal de tê entegre kirin de hindik tê zanîn.13,21
Di vê lêkolînê de, bi hevgirtina mîkroskopiya krîo-elektronî, elektrofîzyolojî û teknîkên girêdana radyolîgandê, me kombûna Nan-Iav û mekanîzmaya girêdana wê bi rêkxerên molekulên piçûk re ronî kir. Wekî din, me kalmodulîna (CaM) ya bi awayekî domdar bi Iav ve girêdayî û pentamerên Nan ên bi AP-stabîlkirî tespît kirin. Ev encam têgihiştinên girîng li ser rêkxistina îyonên kalsiyûmê di kanalan de, kombûna kanalan û faktorên ku eleqeya girêdana lîgandê diyar dikin peyda dikin. Ya girîngtir, me piştrast kir ku ARD di van pêvajoyan de roleke navendî dilîze. Lêkolîna me ya li ser kanalên kêzikan ên temam ên bi dermanên çandiniyê yên têkildar ve girêdayî ne.27, 28, 29ji bo pêşxistina pîşesaziya dermanên kêzikan perspektîfan vedike, bandor û taybetmendiya dermanên kêzikan baştir dike, û dihêle ku pêkhateyên hedefgirtî yên TRPV li ser cureyên din werin sepandin da ku ewlehiya xwarinê ya gerdûnî û belavbûna nexweşiyên ku ji hêla vektoran ve têne veguhastin çareser bikin.
Me her wiha dît ku Nan-Iav ji hêla Ca2+ ve tê rêvebirin, û mekanîzmaya rêkxistinê ji hêla CaM ve bi awayekî domdar ve tê navbeynkar kirin. Ya girîng ew e ku ev rêkxistina Nav a girêdayî Ca2+ ji hêla CaM ve ji mekanîzmayên rêkxistina kanalên îyonê yên din (mînak, kanalên Na+ yên voltaja-dergehkirî û kanalên TRPV5/6) pir cûda dibe.52,53,54,55,56,57Di kanala Nav1.2 de, domaina C-termînal a CaM bi awayekî helîksî bi domaina C-termînal (CTD) ve girêdayî dibe, û Ca2+ girêdana domaina N-termînal a wê bi beşa dûr a CTD ve teşwîq dike.56Di kanala TRPV5/6 de, domaina C-termînal a CaM bi CTH ve girêdide, û Ca2+ berfirehkirina domaina N-termînal a xwe ber bi jor ve ber bi porê ve teşwîq dike, bi vî rengî permeabilîteya katyonê asteng dike.53,54Em modelek ji bo fonksiyona Nan-Iav-CaM ya ji hêla Ca2+ ve tê rêvebirin pêşniyar dikin (Wêne 4h). Di vê modelê de, domaina N-termînal a CaM bi awayekî domdar bi domaina C-termînal (CTH) ya Iav ve girêdide. Di rewşa bêhnvedanê de (têkeliya [Ca2+] kêm), domaina C-termînal a CaM bi Nan re têkilî datîne, konformasyona ARD stabîl dike û bi vî rengî vebûna kanalê pêş dixe. Girêdana agonîst/însektîsîdek bi kanalê ve dibe sedema vebûna poran, ku dibe sedema herikîna Ca2+. Dûv re Ca2+ bi CaM ve girêdide, dibe sedema veqetandina domaina C-termînal ji ARD ya Nan. Ji ber ku astengkirina girêdana CaM bi bingehîn bandora astengker a Ca2+ ji holê radike, ev veqetandin tevgera ARD modul dike, bi vî rengî dibe sedema astengkirin an bêhesasiyetkirina girêdayî Ca2+. Vegerandina bilez a herikînên kanalê piştî derxistina îyonên kalsiyûmê (Wêne 4g) nîşan dide ku ev mekanîzma bersivên bilez ji sînyalên neuronal ên bi navbeynkariya Ca2+ re hêsan dike. Wekî din, hatiye ragihandin ku herêma C-termînal a Iav, ku hîn jî baş nehatiye famkirin, di hedefgirtina kanalê û rêziknameya heyî de rolên din dilîze.21
Di dawiyê de, lêkolîna me avahiya kanala TRP ya bi çareseriya bilind a kompleksa kêzik-kêzikkuj a girîng a çandiniyê pêşkêş dike - keşfek ku berê ji me re nenas bû. Bi taybetî, me avahî û fonksiyona kanala kêzikan di hucreyên mirovan de (HEK293S GnTi–) ne di hucreyên kêzikan de, diyar kir. Li hember berxwedana kêzikkujan a zêde û zexta berdewam li ser ewlehiya xwarinê û patojenan, xebata me agahdariya girîng peyda dike ku dê pêşkeftina kêzikkujên nû ji bo berjewendiya tenduristiya mirovan û ewlehiya xwarinê ya gerdûnî hêsan bike. Lêkolînan nîşan daye ku kêzikkujên wekî AP li dijî hin kêzikan bi bandor in dema ku li gorî rêwerzên etîketê têne bikar anîn û jehrîbûna wan a tûj ji bo tozkerên sûdmend kêm e, ku ewlehiya wan a jîngehê nîşan dide.13,16Herwiha, ceribandina hin derivatîfên AP li ser mêşan nîşan daye ku ew di dawiyê de şiyana xwe ya firînê winda dikin. Fêmkirina ka ev pêkhateyên modulker çawa bi Nan-Iav ve girêdidin dê guhertina pêkhateyên heyî an jî pêşxistina pêkhateyên nû ji bo bandorkertir û... hêsantir bike.tamkontrolkirina kêzikan. Lêkolîna me nîşan dide ku navrûya Nan-Iav ARD ne tenê ji bo rêkxistina çalakiya pêkhateyên endojîn, dermanên kêzikan û Ca2+-CaM, lê di heman demê de ji bo kombûna kanalê jî girîng e. Em pêşniyar dikin ku têkbirina kombûna heterodîmer bi molekulên piçûk dibe ku rêbazek bêhempa û sozdar be ji bo pêşxistina astengkerên kanala îyonê.
Ji heşt genên ortolog, genên dirêjahiya tevahî yên kêzika qehweyî (Halyomorpha halys) Nanchung û Inactive hatin hilbijartin, ku di deterjanan de aramiya pir baş nîşan dan. Genên sentezkirî ji bo îfadeya mirovan bi kodonê hatin çêtirkirin û bi karanîna cihên sînorkirinê yên XhoI û EcoRI di vektora pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) de hatin klonkirin. Vê yekê misoger kir ku klon bi etîketên C-termînal GFP-FLAG-10xHis û mCherry-FLAG-10xHis re di çarçoveyekê de ne, ku ji hêla proteaza HRC-3C (PPX) ve têne parçekirin, û rê dide serbixwebûnaîfadePrîmerên ku ji bo klona Nanchung û Inactive di nav vektora pBacMam de hatine bikar anîn ev bûn:
Wêneyên mîkroskopîk ên perçeyên ferdî li ser mîkroskopa elektronîkî ya veguhestinê ya Titan Krios G2 (FEI) ku bi kamerayek K3 û fîlterek enerjiyê ya Gatan BioQuantum ve hatî sazkirin, hatin girtin. Mîkroskop bi 300 keV, bi mîhenga enerjiyê ya 20 eV, mezinahiya pîkselê ya nimûneyê 1.08 Å/pîksel (mezinbûna nominal 81,000x), û gradyana defokusê ya ji -0.8 heta -2.2 μm hate xebitandin. Tomarkirina vîdyoyê bi 40 çarçove di saniyeyê de bi karanîna mîkroskopa Latitude S (Gatan) bi rêjeya doza nominal 25 e–px−1 s−1, dema ekspozasyonê 2.4 s, û doza giştî ya bi qasî 60 e–Å−2 hate kirin.
Rastkirina tevgera bi tîrêjê ve hatî çêkirin û giraniya dozê li ser fîlmê bi karanîna MotionCor2 di RELION 4.061 de hatin kirin. Texmîna parametreya fonksiyona veguhastina berevajî (CTF) di cryoSPARC de bi karanîna rêbaza texmîna CTF ya li ser bingeha patch62 hate kirin. Fotomîkrografên bi çareseriya lihevhatina CTF ≥4 Å ji analîza paşîn hatin derxistin. Bi gelemperî, komek ji 500-1000 fotomîkrografan ji bo hilbijartina xalan di cryoSPARC de hate bikar anîn, dûv re çend dewreyên dabeşkirina 2D piştî fîlterkirinê hatin bikar anîn da ku wêneyek referansê ya zelal ji bo hilbijartina perçeyên li ser bingeha şablonê were bidestxistin. Dûv re perçe bi karanîna qutiyên sînorkirina 64-pîksel û hevberkirina 4-qatî hatin derxistin. Çend dewreyên dabeşkirina 2D hatin kirin da ku kategoriyên perçeyên nexwestî werin rakirin. Modela destpêkê ya 3D bi karanîna ji nû ve avakirina ab initio hate ji nû ve çêkirin û bi karanîna rafinerkirina neyekreng di cryoSPARC de hate safîkirin. Dabeşkirina 3D di cryoSPARC an RELION de li ser bingeha nehevsengiya ARD hate kirin. Nehevsengiyek girîng a domainên membranê nehat dîtin. Parçe bi karanîna rêbazên C1 û C2 hatin safîkirin; parçeyên bi çareseriya C2 ya bilindtir li gorî C2 wekî simetrîk hatin hesibandin û ji bo safîkirina Bayesian hatin îtxalkirin nav RELION. Piştre parçe ji bo safîkirina dawîn a neyekreng û herêmî vegeriyan cryoSPARC. Çareseriya dawîn û jimara parçeyan di Tabloya 1 de têne nîşandan.
Dema ku pentamerên Nan+AP dihatin pêvajokirin, me rêbazên cûrbecûr ji bo baştirkirina çareseriya domainên parzûnê (bi taybetî herêma poran) lêkolîn kirin, wekî derxistina sînyalê û maskkirina TMD. Lêbelê, ev hewldan ji ber bêserûberiya potansiyel a tund a di herêma poran de û nehevsengiya giştî ya TMD bi ser neketin. Çareseriya dawîn bi karanîna maskek ku bi rêbaza pêvajoya neyekreng di cryoSPARC de bixweber hatî çêkirin, bi giranî herêma ARD hedef digire, hate hesab kirin. Vê yekê çareseriyek pir bilindtir ji ya domainên parzûnê (bi taybetî herêma VSLD) bi dest xist.
Modelên de novo yên destpêkê yên formên apo yên kêzikên Nanchung û Inactive pêşî bi karanîna Coot63 hatin çêkirin, û modelên kêzikên Nan û Iav bi karanîna AlphaFold264 hatin çêkirin da ku herêmên kêm-bawerî werin destnîşankirin. Modelkirina Calmodulin li ser bingeha lihevhatina laşê hişk a modelên girêdana Ca2+ û modelên bê Ca2+ di gihîştinên PDB 4JPZ56 û 1CFD65 de, bi rêzê ve, hate çêkirin. Model bi karanîna rafineriya sferîk hatin safîkirin da ku stereokîmyaya rast û geometrîya baş were misoger kirin. Dûv re fosfatîdîlkolîn, fosfatîdîletanolamîn, û fosfatîdîlserîn wekî dendikên lîpîd ên baş-diyarkirî hatin model kirin, û lîgandên NAM û AP di dendikên têkildar de di girêdanên teng de hatin danîn. Pelên sînorkirinê ji rêza SMILES a îzoforman bi karanîna eLBOW di PHENIX66 de hatin çêkirin. Di dawiyê de, model di qada rastîn de di PHENIX de bi karanîna lêgerîna tora herêmî û kêmkirina gerdûnî bi sînorkirinên avahiya duyemîn hatin safîkirin. Servera MolProbity ji bo rafinandina modelê û analîza avahîsaziyê hate bikar anîn, û wêne bi karanîna PyMOL û UCSF Chimera X hatin kirin. 67,68,69 Analîza vebûnê bi karanîna servera HOLE hate kirin,70 û nexşeya parastina rêzê bi karanîna servera Consurf hate kirin.71
Analîza îstatîstîkî bi karanîna Igor Pro 6.2, Excel Office 365, û GraphPad Prism 7.0 hate kirin. Hemû daneyên hejmarî wekî navînî ± xeletiya standard (SEM) têne pêşkêş kirin. Testa t-ya Student (du-alî, nehevber) ji bo berhevdana du koman hate bikar anîn. Analîza guherbariya yekalî (ANOVA) û piştre testa post hoc ya Dunnett ji bo berhevdana gelek koman hate bikar anîn. *P< 0.05, **P< 0.01, û ***P< 0.001 li gorî belavbûna daneyan ji hêla îstatîstîkî ve girîng hatin hesibandin. Nirxên Kd, Ki, û navberên baweriya wan ên asîmetrîk ên 95% bi karanîna GraphPad Prism 10 hatin hesab kirin.
Ji bo bêtir agahdarî li ser metodolojiya lêkolînê, ji kerema xwe li Kurteya Rapora Portfoliyoya Xwezayê ya ku di vê gotarê de girêdayî ye binêrin.
Modela destpêkê bi karanîna modelên kalmodulînê ji databasa PDB 4JPZ û 1CFD hate çêkirin. Koordînat di Bankeya Daneyên Proteînê (PDB) de bi hejmarên gihîştinê 9NVN (Nan-Iav-CaM bê lîgand), 9NVO (Nan-Iav-CaM bi nîkotînamîd ve girêdayî), 9NVP (Nan-Iav-CaM bi nîkotînamîd û EDTA ve girêdayî), 9NVQ (Nan-Iav-CaM bi afenidolpîrrolîn û kalsiyûm ve girêdayî), 9NVR (Nan-Iav-CaM bi afenidolpîrrolîn û EDTA ve girêdayî), û 9NVS (Nan pentamer bi afenidolpîrrolîn ve girêdayî) hatine danîn. Wêneyên mîkroskopiya krîo-elektronî yên têkildar di Databasa Mîkroskopiya Elektronî (EMDB) de di bin hejmarên gihîştinê yên jêrîn de hatine hilanîn: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM bê lîgand), EMD-49845 (Kompleksa Nan-Iav-CaM bi nîkotînamîd re), EMD-49846 (Kompleksa Nan-Iav-CaM bi nîkotînamîd û EDTA re), EMD-49847 (Kompleksa Nan-Iav-CaM bi aphidopyrrollin û kalsiyûm re), EMD-49848 (Kompleksa Nan-Iav-CaM bi aphidopyrrollin û EDTA re), û EMD-49849 (Kompleksa Nan pentamer bi aphidopyrrollin re). Daneyên xav ji bo analîza fonksiyonel di vê gotarê de têne pêşkêş kirin.
Dema weşandinê: 28ê rêbendana 2026an