Ji bo mîmariya stûnê mezinbûna merîstema apical (SAM) girîng e. Hormonên nebatangibberellins(GA) di hevrêzkirina mezinbûna nebatan de rolên sereke dilîzin, lê rola wan di SAM de kêm tê fam kirin. Li vir, me bi endezyariya proteîna DELLA ve biyosensorek ratyometrîkî ya nîşana GA-yê pêşxist da ku fonksiyona wê ya rêziknameyê ya bingehîn a di bersiva veguheztina GA-yê de bitepisîne dema ku hilweşîna wê li ser naskirina GA-yê biparêze. Em destnîşan dikin ku ev biyosensorê-bingeha hilweşandinê di dema pêşkeftinê de guhertinên di astên GA û hestiyariya hucreyî de rast tomar dike. Me ev biosensor bikar anî da ku çalakiya nîşana GA-yê di SAM-ê de nexşe bike. Em destnîşan dikin ku îşaretên GA-ya bilind bi giranî di hucreyên ku di navbera organên primordiya de ne, ku pêşengên hucreyên navrû ne, hene. Bi karanîna nêzîkbûnên destkeftî û windakirina fonksiyonê, em bêtir destnîşan dikin ku GA rêgezkirina balafirgeha dabeşkirina hucreyê bi rê ve dibe, rêxistina hucreyî ya kanonîkî ya navbendan saz dike, bi vî rengî taybetmendiya navberê di SAM-ê de pêşve dike.
Merîstema apîkal a gulikê (SAM), ku li lûtkeya gulikê ye, navçeyek hucreyên stem dihewîne ku çalakiya wan organên paşîn û girêkên stûnê bi rengek modular û dubare li seranserê jiyana nebatê diafirîne. Her yek ji van yekeyên dubare, an jî girêkên nebatan, di nav girêkan de navgiran û organên alîgir, û di paçikên pelan de merîstemên axillary1 hene. Mezinbûn û organîzekirina girêkên nebatan di dema geşbûnê de diguhere. Di Arabidopsis de, mezinbûna navgiran di qonaxa nebatî de tê tepisandin, û merîstemên axillary di axînên pelên rozetê de razayî dimînin. Di dema derbasbûna qonaxa kulîlkan de, SAM dibe merîstema kulîlkan, navgiranên dirêjkirî û gûçikên axillary, şaxên di nav palên pelên cauline de, û paşê, kulîlkên bê pel çêdike2. Her çend me di têgihiştina mekanîzmayên ku destpêkirina pel, kulîlk û şaxan de kontrol dikin de pêşkeftinek girîng bi dest xistiye jî, di derheqê ka meriv çawa diqewime de hindik tê zanîn.
Fêmkirina belavkirina cîhê-demî ya GA dê bibe alîkar ku hûn fonksiyonên van hormonan di tevnên cihêreng de û di qonaxên pêşkeftina cihêreng de baştir fam bikin. Dîmenîkirina hilweşandina hevgirtina RGA-GFP ya ku di bin çalakiya promotorê xwe de tête diyar kirin agahdariya girîng li ser rêziknameya asta tevahî GA-yê di kokan de peyda dike15,16. Lêbelê, vegotina RGA di nav tevnan de diguhere17 û ji hêla GA18 ve tê rêve kirin. Ji ber vê yekê, vegotina cihêreng a pêşvebirê RGA dibe ku bibe sedema şêwaza fluorescence ya ku bi RGA-GFP-ê tê dîtin û ji ber vê yekê ev rêbaz ne mîqdar e. Di van demên dawî de, bioaktîf fluorescein (Fl) GA19,20 kombûna GA-yê di endokortexê root de û rêkûpêkkirina astên wê yên hucreyî ji hêla veguheztina GA ve eşkere kir. Di van demên dawî de, sensorê GA FRET nlsGPS1 destnîşan kir ku astên GA bi dirêjbûna hucreyê di kok, filament û hîpokotilên tarî-mezinbûyî21 re têkildar in. Lêbelê, wekî ku me dît, hûrbûna GA ne tenê parametre ye ku çalakiya îşaretkirina GA-yê kontrol dike, ji ber ku ew bi pêvajoyên hestyariya tevlihev ve girêdayî ye. Li vir, li ser têgihîştina me ya rêyên nîşana DELLA û GA-yê ava dikin, em pêşveçûn û taybetmendiya biyosensorek ratiometrîk-bingeha hilweşandinê ji bo nîşana GA radigihînin. Ji bo pêşdebirina vê bîyosensorê mîqdar, me RGA-ya-hesas a mutant bikar anî ku bi proteînek fluorescentê re hat hevûdu û bi gelemperî di nav tevnan de hate xuyang kirin, û her weha proteînek fluorescent a GA-bêhesas. Em destnîşan dikin ku tevhevkirina proteîna RGA ya mutant dema ku bi gelemperî tête diyar kirin destwerdana nîşana GA-ya endojen nade, û ku ev biosensor dikare çalakiya nîşankirinê ya ku hem ji ketina GA û hem jî ji hilberandina sînyala GA-yê ji hêla amûra hîskirinê ve bi çareseriya cîhê-demî ya bilind ve tête pîvandin. Me ev biyosensor bikar anî da ku nexşeya dabeşkirina cîhê-demî ya çalakiya nîşana GA-yê nexşe bike û bihejmêre ka GA çawa behreya hucreyî li ser epidermisê SAM-ê bi rê ve dibe. Em destnîşan dikin ku GA rêgeza dabeşkirina hucreyên SAM-ê yên ku di navbera organê primordia de cih digirin rêve dike, bi vî rengî rêxistina hucreyî ya kanonîkî ya navrûyê diyar dike.
Di dawiyê de, me pirsî gelo qmRGA dikare guhertinên di asta GA-ya endojen de bi karanîna hîpokotilên mezinbûyî rapor bike. Me berê destnîşan kir ku nîtrat bi zêdekirina senteza GA û, di encamê de, hilweşîna DELLA34, mezinbûnê teşwîq dike. Li gorî vê yekê, me dît ku dirêjahiya hîpokotîlê di tovên pUBQ10:: qmRGA yên ku di bin dabînkirina nîtratê ya zêde (10 mM NO3-) de mezin bûne, ji ya di tovên ku di bin şert û mercên kêmbûna nîtratê de mezin bûne, bi girîngî dirêjtir bû (Hêjmara Pêvek. 6a). Li gorî berteka mezinbûnê, îşaretên GA-yê di hîpokotîlên şitilên ku di bin şert û mercên 10 mM NO3− de hatine mezin kirin de ji tovên ku di nebûna nîtratê de mezin bûne, bilindtir bûn (Hêjmara Pêvek. 6b, c). Ji ber vê yekê, qmRGA di heman demê de çavdêriya guheztinên nîşana GA-yê ku ji hêla guheztinên endojen ên di berhevoka GA-yê de têne çêkirin jî dike.
Ji bo ku em fêm bikin ka çalakiya nîşana GA ya ku ji hêla qmRGA ve hatî vedîtin bi giraniya GA û têgihîştina GA ve girêdayî ye, wekî ku li ser bingeha sêwirana senzorê tê hêvî kirin, me vegotina sê receptorên GID1 di tevnên nebatî û hilberîner de analîz kir. Di şitilan de, rêza nûçegihanê GID1-GUS destnîşan kir ku GID1a û c di kulikan de pir têne xuyang kirin (Hêjîrê. 3a-c). Digel vê yekê, her sê receptor di pelan de, primordiya rokê alîgir, tîrên kokê (ji xeynî kapaxa koka GID1b), û pergala damaran (Hêjîr. 3a-c) de hatine diyar kirin. Di kulîlka SAM-ê de, me îşaretên GUS tenê ji bo GID1b û 1c tesbît kir (Hêjmara Pêvek. 7a–c). Hîbrîdîzasyona li cîhê van şêwazên vegotinê piştrast kir û bêtir destnîşan kir ku GID1c di SAM-ê de di astên nizm de bi yekrengî hate xuyang kirin, lê GID1b li derûdora SAM-ê îfadeya bilindtir nîşan da (Hêjmara Pêvek. 7d-l). PGID1b::2xmTQ2-GID1b hevbendiya wergerî di heman demê de rêgezek birêkûpêk a îfadeya GID1b jî eşkere kir, ji kêm an bê îfadeya li navenda SAM-ê heya bilêvkirina bilind a li ser sînorên organan (Hêjmara Pêvek. 7m). Bi vî rengî, receptorên GID1 bi yekcarî li ser û di hundurê tevnvîsan de têne belav kirin. Di ceribandinên paşerojê de, me her weha dît ku derbirîna zêde ya GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) hesasiyeta qmRGA di hîpokotilan de li ser sepana GA-ya derve zêde kir (Hêjî. 3d, e). Berevajî vê, fluoresansa ku ji hêla qd17mRGA ve di hîpokotîlê de tê pîvandin ji dermankirina GA3 re nehesas bû (Wêne. 3f, g). Ji bo her du vekolînan, tov bi giranbûnek bilind a GA (100 μM GA3) hatin derman kirin da ku tevgera bilez a senzorê binirxîne, li cihê ku şiyana girêdana bi receptorê GID1 re zêde bû an winda bû. Bi hev re, van encaman piştrast dikin ku biosensora qmRGA fonksiyonek hevgirtî wekî senzorek GA û GA re xizmet dike, û pêşniyar dikin ku vegotina cihêreng a receptorê GID1 dikare bi girîngî veguheztina senzorê modul bike.
Heya nuha, belavkirina sînyalên GA-yê di SAM-ê de ne diyar e. Ji ber vê yekê, me nebatên diyarker qmRGA û nûçegihana hucreya stemê ya pCLV3::mCherry-NLS35 bikar anîn da ku nexşeyên mîqdar ên bi rezîliya bilind ên çalakiya îşaretkirina GA-yê hesab bikin, ku balê dikişîne ser tebeqeya L1 (epîdermîs; Fig. 4a, b, Rêbaz û Rêbazên Pêvek ên Kontrolkirina SAM a L31 a rola sereke dilîzin a L31-ê bibînin). Li vir, îfadeya pCLV3::mCherry-NLS ji bo analîzkirina belavkirina cîhê-demî ya çalakiya nîşana GA37 xalek referansa geometrîkî ya sabît peyda kir. Her çend GA ji bo pêşkeftina organên paşîn girîng tê hesibandin4, me dît ku îşaretên GA di primordyuma kulîlkan (P) de ji qonaxa P3 (Hêjî. 4a, b) dest pê dike kêm bûn, lê primordiumên P1 û P2 yên ciwan xwedan çalakiyek nerm mîna ya li herêma navendî (Hêjî. 4a, b) bûn. Çalakiya sînyala GA ya bilind li tixûbên organê primordyûmê, ji P1/P2 (li aliyên sînor) dest pê dike û li P4-ê bilind dibe, û hem jî li hemî şaneyên devera derdorî ya ku di navbera prîmordîyayê de cih digire, hate tespît kirin (Hêjî. 4a, b û Hêjmara Pêvek. 8a, b). Ev çalakiya îşaretkirina GA ya bilind ne tenê di epîdermisê de lê di heman demê de di qatên L2 û L3 yên jorîn de jî hate dîtin (Hêjmara Pêvek. 8b). Nimûneya sînyalên GA-yê yên ku di SAM-ê de bi karanîna qmRGA-yê hatine vedîtin jî bi demê re neguherî maye (Hêjmara Pêvek. 8c–f, k). Her çend avakirina qd17mRGA bi rêkûpêk di SAM-a nebatên T3 de ji pênc xetên serbixwe yên ku me bi hûrgulî destnîşan kirin hate verast kirin, me karîbû şêwazên floransê yên ku bi avahiyek pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP hatine wergirtin analîz bikin (Hêzên pêvek. 8g–j, l). Di vê xeta kontrolê de, tenê guhertinên piçûk di rêjeya floransê de di SAM-ê de hatin tesbît kirin, lê li navenda SAM-ê me kêmbûnek zelal û nediyar li VENUS-ê ku bi TagBFP ve girêdayî ye dît. Ev piştrast dike ku şêwaza nîşankirinê ya ku ji hêla qmRGA ve hatî dîtin hilweşîna mRGA-VENUS-a-girêdayî GA nîşan dide, lê di heman demê de destnîşan dike ku qmRGA dibe ku çalakiya îşaretkirina GA-yê li navenda meristem zêde texmîn bike. Bi kurtahî, encamên me şêwazek nîşana GA-yê ku di serî de belavkirina primordia nîşan dide diyar dike. Ev belavkirina herêma nav-seretayî (IPR) ji ber damezrandina gav bi gav çalakiya îşaretkirina GA ya bilind di navbera primordyuma pêşkeftî û devera navendî de ye, di heman demê de çalakiya îşaretkirina GA li prîmordyûmê kêm dibe (Hêjî. 4c, d).
Dabeşkirina receptorên GID1b û GID1c (li jor binêre) destnîşan dike ku vegotina cihêreng a receptorên GA-ê di SAM-ê de arîkariya şêwaza çalakiya nîşankirina GA-yê dike. Me meraq kir gelo dibe ku berhevkirina cihêreng a GA têkildar be. Ji bo vekolîna vê gengaziyê, me sensor21 nlsGPS1 GA FRET bikar anî. Di SAM-a nlsGPS1-ê de ku 100 hûrdem bi 10 μM GA4+7 ve hatî derman kirin de frekansa aktîfkirinê ya zêde hate tesbît kirin (Wêjeya Pêvek. 9a–e), ev destnîşan dike ku nlsGPS1 bersivê dide guheztinên giraniya GA-yê di SAM-ê de, wekî ku di roots21 de dike. Dabeşkirina mekanî ya frekansa aktîfkirina nlsGPS1 astên GA-yê yên nisbeten kêm di qatên derve yên SAM-ê de eşkere kir, lê destnîşan kir ku ew li navendê û li sînorên SAM-ê bilind bûne (Wêne. 4e û Hêjmara Pêvek. 9a,c). Ev pêşniyar dike ku GA di heman demê de di SAM-ê de bi şêwazek cîhê ku bi ya ku ji hêla qmRGA ve hatî eşkere kirin ve tê berhev kirin. Wekî nêzîkatiyek temamker, me di heman demê de SAM-ê bi GA-ya fluorescent (GA3-, GA4-, GA7-Fl) an Fl tenê wekî kontrolek neyînî derman kir. Nîşana Fl li seranserê SAM-ê, di nav devera navendî û primordium de, her çend bi şiddetek kêmtir be jî hate belav kirin (Hêjîr. 4j û Hêjmara Pêvek. 10d). Berevajî vê, her sê GA-Fl bi taybetî di nav tixûbên primordiumê de û bi dereceyên cihêreng di nav IPR-a mayî de kom bûne, digel ku GA7-Fl di qada herî mezin a IPR de kom dibe (Hêjî. 4k û Hêjmara Pêvek. 10a,b). Hêjdarkirina tundiya floransê diyar kir ku rêjeya tundiya IPR-ê ya ne-IPR di SAM-a ku bi GA-Fl-ê hatî dermankirin de li gorî SAM-a-dermankirî ya Fl-ê bilindtir bû (Wêne. 4l û Hêjmara Pêvek. 10c). Bi hev re, van encaman destnîşan dikin ku GA di hucreyên IPR-ê yên ku herî nêzê sînorê organê ne de di hûrguliyên bilind de heye. Ev pêşniyar dike ku şêwaza çalakiya nîşana SAM GA hem ji vegotina cihêreng a receptorên GA û hem jî ji berhevkirina cihêreng a GA di hucreyên IPR de li nêzî sînorên organan encam dide. Bi vî rengî, analîza me şêwazek cîhê-demkî ya nediyar a nîşana GA-yê, bi çalakiya kêmtir li navend û primordiumê SAM-ê û çalakiya bilindtir di IPR-ê de li devera derdor eşkere kir.
Ji bo ku em rola çalakiya nîşana GA-ya cihêreng a di SAM-ê de fam bikin, me pêwendiya di navbera çalakiya îşaretkirina GA, berfirehbûna hucreyê, û dabeşkirina hucreyê de bi karanîna wênekêşiya dem-dema rast a SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS analîz kir. Ji ber rola GA di rêziknameya mezinbûnê de, têkiliyek erênî bi parametreyên berfirehkirina hucreyê re hate hêvî kirin. Ji ber vê yekê, me pêşî nexşeyên çalakiya îşaretkirina GA-yê bi nexşeyên rêjeya mezinbûna rûbera şaneyê re (wek nîgarek ji bo hêza berfirehbûna şaneyê ji bo şaneyek diyarkirî û ji bo şaneyên keç ên di dabeşbûnê de) û bi nexşeyên anîsotropiya mezinbûnê re, ku rêwerziya berfirehbûna şaneyê dipîve (li vir ji bo şaneyek diyarkirî û ji bo şaneyên keç ên di dabeşbûnê de tê bikar anîn; Fig. Nexşeyên me yên rêjeya mezinbûna rûbera hucreya SAM bi çavdêriyên berê38,39 re hevaheng in, bi rêjeyên mezinbûnê yên hindiktirîn li ser sînor û rêjeyên mezinbûnê yên herî zêde di kulîlkên pêşkeftî de (Wêne. 5a). Analîzkirina pêkhateya bingehîn (PCA) destnîşan kir ku çalakiya nîşana GA-yê bi tundiya mezinbûna rûbera hucreyê re neyînî têkildar bû (Wêne 5c). Me her weha destnîşan kir ku axên bingehîn ên guheztinê, di nav de têketina nîşana GA û tundiya mezinbûnê, li gorî rêgeza ku ji hêla vegotina bilind a CLV3 ve hatî destnîşan kirin ortogonal bûn, di analîzên mayî de derxistina hucreyan ji navenda SAM piştrast kir. Analîza pêwendiya Spearman encamên PCA-yê piştrast kir (Wêne 5d), û destnîşan dike ku nîşanên GA-ya bilind di IPR-ê de nebûn encamek mezinbûna hucreyê. Lêbelê, analîza pêwendiyê têkiliyek erênî ya sivik di navbera çalakiya nîşankirina GA û anîsotropiya mezinbûnê de (Wêne 5c, d) eşkere kir, pêşniyar dike ku nîşana GA-ya bilind a di IPR de bandorê li rêberiya mezinbûna hucreyê dike û dibe ku pozîsyona balafira dabeşkirina hucreyê bandor bike.
a, b Nexşeyên germê yên mezinbûna rûbera navîn (a) û anîsotropiya mezinbûnê (b) di SAM-ê de li ser heft nebatên serbixwe (bi rêzê, ji bo hêz û arastekirina berbelavbûna hucreyê wekî proxy têne bikar anîn). c Analîza PCA guhêrbarên jêrîn vedihewîne: sînyala GA, zexmbûna mezinbûna rûvî, anîsotropiya mezinbûna rûvî, û îfadeya CLV3. Parçeya PCA 1 bi gelemperî bi tundiya mezinbûna rûkalê re neyînî û bi nîşana GA re têkildar bû. Parçeya PCA 2 bi gelemperî bi anîsotropiya mezinbûna rûkalê re bi erênî ve girêdayî bû û bi vegotina CLV3 re bi neyînî ve girêdayî bû. Ji sedî guhertoya ku ji hêla her pêkhateyê ve hatî ravekirin temsîl dikin. d Analîza pêwendiya Spearman di navbera sînyala GA, tundiya mezinbûna rûkê, û anîsotropiya mezinbûna rûxê de li pîvana tevnvîsê ji bilî CZ. Hejmara li rastê nirxa Spearman rho di navbera du guherbaran de ye. Stêrk rewşên ku têkiliyek/têkiliya neyînî pir girîng e destnîşan dikin. e Dîmendarkirina 3D ya hucreyên Col-0 SAM L1 bi mîkroskopiya konfokal. Dîwarên hucreyê yên nû ku di SAM-ê de (lê ne prîmordium) di 10 demjimêran de têne çêkirin, li gorî nirxên goşeya xwe têne reng kirin. Barê rengîn di quncika jêrîn ya rastê de tê xuyang kirin. Inset wêneya 3D ya têkildar di 0 demjimêran de nîşan dide. Ezmûn bi encamên heman du caran hate dubare kirin. f Planên qutikê rêjeyên dabeşbûna şaneyê di IPR û ne-IPR Col-0 SAM de (n = 10 nebatên serbixwe) nîşan didin. Xeta navendê navîn nîşan dide, û sînorên qutikê sedî 25 û 75 nîşan dide. Whiskers nirxên herî kêm û herî zêde yên ku bi nermalava R-yê hatine destnîşankirin destnîşan dikin. Nirxên P-ê bi testa t-tîrêjê ya Welch-ê hatin wergirtin. g, h Diyagrama şematîkî ku (g) nîşan dide ka meriv çawa goşeya dîwarê hucreya nû (magenta) bi rêzgirtina arasteka radîkal a ji navenda SAM (xêza xalî ya spî) tê pîvandin (tenê nirxên goşeyê tûj, ango, 0-90°, têne hesibandin), û (h) rêgezên dorberî/alî û radîkal ên di hundurê merîstemê de. i Histogramên frekansê yên arastekirina balafira dabeşkirina hucreyê bi rêzê li seranserê SAM (şîna tarî), IPR (şîna navîn), û ne-IPR (şîna sivik). Nirxên P-ê bi ceribandinek Kolmogorov-Smirnov-a du-dil hatin wergirtin. Ezmûn bi encamên heman du caran hate dubare kirin. j Histogramên frekansê yên arastekirina plana dabeşkirina hucreyê ya IPR bi rêzê li dora P3 (kesk sivik), P4 (kesk navîn), û P5 (kesk tarî). Nirxên P-ê bi ceribandinek Kolmogorov-Smirnov-a du-dil hatin wergirtin. Ezmûn bi encamên heman du caran hate dubare kirin.
Ji ber vê yekê, me paşê bi destnîşankirina dîwarên şaneyên nû çêbûyî di dema ceribandinê de têkiliya di navbera sînyala GA û çalakiya dabeşbûna şaneyan de lêkolîn kir (Wêne 5e). Vê rêbazê rê da me ku em frekans û rêça dabeşbûna şaneyan bipîvin. Bi awayekî ecêb, me dît ku frekans dabeşbûna şaneyan di IPR û mayî ya SAM (ne-IPR, Wêne 5f) de dişibihe hev, ku nîşan dide ku cûdahiyên di sînyala GA de di navbera şaneyên IPR û ne-IPR de bandorek girîng li ser dabeşbûna şaneyan nakin. Ev, û têkiliya erênî di navbera sînyala GA û anîzotropiya mezinbûnê de, me han da ku em bifikirin ka çalakiya sînyala GA dikare bandorê li rêça balafira dabeşbûna şaneyan bike. Me arasteya dîwarê şaneya nû wekî goşeyek tûj li gorî eksena radyal a ku navenda merîstemê û navenda dîwarê şaneya nû bi hev ve girêdide pîvand (Wêne 5e-i) û meylek zelal a dabeşbûna şaneyan li goşeyên nêzîkî 90° li gorî eksena radyal dît, bi frekansên herî bilind li 70-80° (23.28%) û 80-90° (22.62%) hatin dîtin (Wêne 5e,i), ku bi dabeşbûna şaneyan di rêça dorhêl/berfireh de re têkildar in (Wêne 5h). Ji bo lêkolîna beşdariya sînyala GA di vê tevgera dabeşbûna şaneyê de, me parametreyên dabeşbûna şaneyan di IPR û ne-IPR de ji hev cuda analîz kirin (Wêne 5i). Me dît ku belavbûna goşeya dabeşkirinê di hucreyên IPR de ji ya hucreyên ne-IPR an jî di hucreyên di tevahiya SAM de cuda ye, hucreyên IPR rêjeyek bilindtir a dabeşkirinên hucreyên alî/dorhêl nîşan didin, ango, 70-80° û 80-90° (bi rêzê ve 33.86% û 30.71%, rêjeyên têkildar) (Wêne 5i). Bi vî awayî, çavdêriyên me têkiliyek di navbera sînyala GA ya bilind û arasteya balafira dabeşkirina hucreyê ya nêzîkî arasteya dorhêl de eşkere kirin, dişibihe têkiliya di navbera çalakiya sînyala GA û anîzotropiya mezinbûnê de (Wêne 5c, d). Ji bo ku em parastina cîhî ya vê têkiliyê bêtir saz bikin, me arasteya balafira dabeşkirinê di hucreyên IPR de ku ji P3 dest pê dikin li dora primordiumê pîva, ji ber ku çalakiya sînyala GA ya herî bilind di vê herêmê de ji P4 dest pê dike hate tespît kirin (Wêne 4). Goşeyên dabeşkirinê yên IPR li dora P3 û P4 cûdahiyên girîng ên îstatîstîkî nîşan nedan, her çend frekansek zêde ya dabeşkirinên hucreyên alî di IPR de li dora P4 hate dîtin (Wêne 5j). Lêbelê, di hucreyên IPR-ê yên li dora P5-ê de, cudahiya di arasteya plana dabeşbûna hucreyê de ji hêla îstatîstîkî ve girîng bû, bi zêdebûnek tûj di pirbûna dabeşbûnên hucreyê yên transversal de (Wêne 5j). Bi hev re, ev encam pêşniyar dikin ku sînyala GA dikare arasteya dabeşbûnên hucreyê di SAM-ê de kontrol bike, ku ev yek bi raporên berê re lihevhatî ye40,41 ku sînyala GA-ya bilind dikare arasteya alî ya dabeşbûnên hucreyê di IPR-ê de çêbike.
Tê pêşbînîkirin ku hucreyên di IPR de dê ne di nav primordia de, lê di nav navberên 2,42,43 de bêne bicîh kirin. Arasteya veguhêz a dabeşên hucreyê di IPR de dibe ku bibe sedema organîzasyona tîpîk a rêzikên dirêjî yên paralel ên hucreyên epidermal ên di navberan de. Çavdêriyên me yên ku li jor hatine destnîşan kirin destnîşan dikin ku nîşana GA-ê di vê pêvajoyê de bi rêkûpêkkirina rêgeza dabeşkirina hucreyê dibe rolek dilîze.
Wendakirina fonksiyona gelek genên DELLA dibe sedema bersivek GA-ya avaker, û mutantên della dikarin ji bo ceribandina vê hîpotezê werin bikar anîn44. Me pêşî şêwazên îfadeya pênc genên DELLA di SAM de analîz kir. Têkiliya transkrîpsîyonî ya xeta GUS45 eşkere kir ku GAI, RGA, RGL1, û RGL2 (bi rêjeyek pir hindiktir) di SAM-ê de hatine diyar kirin (Hêjmara Pêvek. 11a–d). Hîbrîdîzasyona di cih de bêtir destnîşan kir ku GAI mRNA bi taybetî di primordia û kulîlkên pêşkeftî de kom dibe (Hêjmara Pêvek. 11e). RGL1 û RGL3 mRNA li seranserê kaniya SAM û di kulîlkên pîr de hatin tesbît kirin, lê RGL2 mRNA li herêma sînor pirtir bû (Hêjmara Pêvek. 11f–h). Wêneya konfokal a pRGL3:: RGL3-GFP SAM îfadeya ku ji hêla hîbrîdîzasyona li cih ve hatî dîtin piştrast kir û destnîşan kir ku proteîna RGL3 li beşa navendî ya SAM-ê kom dibe (Hêjmara Pêvek. 11i). Bi karanîna xeta pRGA::GFP-RGA, me her weha dît ku proteîna RGA di SAM-ê de kom dibe, lê pirbûna wê li ser sînorê ku ji P4-ê dest pê dike kêm dibe (Hêjmara Pêvek. 11j). Nemaze, şêwazên derbirînê yên RGL3 û RGA bi çalakiya îşaretkirina GA-ya bilind a di IPR-ê de, wekî ku ji hêla qmRGA ve hatî tespît kirin re hevaheng in (Wêne. 4). Wekî din, van daneyan destnîşan dikin ku hemî DELLA di SAM-ê de têne diyar kirin û ku îfadeya wan bi hev re tevahiya SAM-ê vedigire.
Dûv re me parametreyên dabeşkirina hucreyê di SAM-a-cûre (Ler, kontrol) û gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della mutantên pêncalî (gerdûnî) de analîz kirin (Hêjî. 6a, b). Balkêş e, me di belavkirina frekansên goşeya dabeşkirina hucreyê de di della gerdûnî ya mutant SAM de li gorî celebê çolê veguheztinek girîng a îstatîstîkî dît. Ev guhertin di mutantê gerdûnî de ji ber zêdebûna frekansa goşeyan 80-90° bû (34,71% beramberî 24,55%) û, hinekî jî, goşeyan 70-80° (% 23,78 beramberî 20,18%), ango, bi dabeşkirina şaneyên gerguhêz re têkildar e (6c). Frekansa dabeşên ne-transversal (0-60°) di mutantê della gerdûnî de jî kêmtir bû (Hêjîrê. 6c). Frekansa dabeşkirina hucreyên transversal di SAM-a della mutantê gerdûnî de bi girîngî zêde bû (Hêjî. 6b). Rêjeya dabeşên hucreya transversal di IPR de jî di della mutantê gerdûnî de li gorî celebê çolê bilindtir bû (Hêjîrê. 6d). Li derveyî herêma IPR, celebê çolê xwedan dabeşek yekrengtir a goşeyên dabeşkirina hucreyê bû, lê mutantê gerdûnî yê della dabeşên tangential ên mîna IPR tercîh dikir (Wêne. 6e). Me di heman demê de rêgezên dabeşên hucreyê di SAM-ê de mutantên pêncalî yên ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, û ga2ox6-2), paşxaneyek mutantek GA-neçalak ku tê de GA accumul dike, pîvan kir. Bi zêdebûna astên GA re, SAM-ya kulîlka mutant a ga2ox ya pênccarî ji ya Col-0 mezintir bû (Wêjeya Zêdeyî 12a, b), û li gorî Col-0-ê, ga2ox SAM-ya pênccarî belavbûnek cûda cûda ya frekansa dabeşbûna şaneyê ji 9° re ji 9° ber bi goşeya dabeşbûna şaneyê ve nîşan da, bi goşeya 50° dîsa zêde dibe. dabeşkirin (Hêjmara Pêvek. 12a–c). Bi vî rengî, em destnîşan dikin ku aktîvkirina damezrîner a sînyala GA û berhevkirina GA dabeşên hucreya paşîn di IPR û mayî ya SAM-ê de çêdike.
a, b Dîmendarkirina 3D ya tebeqeya L1 ya PI-rengkirî Ler (a) û della mutant (b) SAM bi karanîna mîkroskopa konfokal. Dîwarên hucreyê yên nû ku di SAM-ê de (lê ne prîmordium) di heyamek 10-h de hatine çêkirin, li gorî nirxên goşeya xwe têne xuyang kirin û rengîn kirin. Inset SAM di 0 h de nîşan dide. Barê rengîn di quncikê jêrîn ê rastê de tê xuyang kirin. Tîra di (b) de mînakek pelên hucreyê yên rêzkirî yên di della mutantê ya gerdûnî de nîşan dide. Ezmûn bi encamên heman du caran hate dubare kirin. hevberdana belavkirina frekansê ya arasteyên plana dabeşkirina şaneyê di tevahiya SAM (d), IPR (e), û ne-IPR (f) de di navbera Ler û della gerdûnî de. Nirxên P bi karanîna testek Kolmogorov-Smirnov du-dil hatin wergirtin. f, g Dîmendarkirina 3D ya wêneyên konfokal ên SAM-ê yên PI-rengkirî yên Col-0 (i) û pCUC2::gai-1-VENUS (j) nebatên transgenîkî. Panelên (a, b) dîwarên hucreyê yên nû (lê ne primordia) ku di SAM-ê de di nav 10 demjimêran de hatine çêkirin nîşan didin. Ezmûn bi encamên heman du caran hate dubare kirin. h–j Berawirdkirina belavkirina frekansê ya arasteyên plana dabeşkirina şaneyê ku di tevahiya SAM (h), IPR (i) û ne-IPR (j) de di navbera nebatên Col-0 û pCUC2::gai-1-VENUS de cih digirin. Nirxên P bi karanîna testa Kolmogorov-Smirnov ya du-dil hatine wergirtin.
Dûv re me bandora astengkirina nîşana GA-yê bi taybetî di IPR de ceriband. Ji bo vê armancê, me promotorê kasa cotyledon 2 (CUC2) bikar anî da ku îfadeya proteînek neyînî ya gai-1 ya serdest a ku bi VENUS-ê ve hatî hevgirtî (di rêza pCUC2:: gai-1-VENUS) de bimeşîne. Di SAM-a celeb-çovî de, promotorê CUC2 îfadeya piraniya IPR-ên di SAM-ê de, tevî şaneyên sînor, ji P4 û pê ve dimeşîne, û îfadeya taybetî ya bi vî rengî di nebatên pCUC2::gai-1-VENUS de hate dîtin (li jêr binêre). Belavbûna goşeyên dabeşbûna şaneyê li ser SAM an IPR-a nebatên pCUC2::gai-1-VENUS bi girîngî ji ya celebê çolê ne cûda bû, her çend neçaverêkî me dît ku şaneyên bê IPR di van nebatan de bi frekansek bilindtir 80-90° dabeş dibin (Hêl. 6f-j).
Pêşniyar kirin ku rêgeziya dabeşkirina şaneyê bi geometriya SAM ve girêdayî ye, nemaze tansiyona tansiyonê ya ku ji hêla keviya tevnê ve çêdibe46. Ji ber vê yekê me pirsî ka şiklê SAM-ê di mutantê gerdûnî della û nebatên pCUC2:::gai-1-VENUS de hate guheztin an na. Wekî ku berê hate ragihandin12, mezinahiya mutantê ya gerdûnî ya della SAM ji ya celebê çolê mezintir bû (Hêjmara Pêvek. 13a, b, d). Di cih de hîbrîdîzasyona CLV3 û STM RNA berfirehbûna merîstemê di mutantên della de piştrast kir û bêtir berfirehbûna paşîn a xêzika hucreya stem nîşan da (Hêjmara Pêvek. 13e, f, h, i). Lêbelê, kêşeya SAM-ê di her du jenotîp de wekhev bû (Hêjîra pêvek. 13k, m, n, p). Me di mutantê çaralî de gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della de bê guheztinek di kêşanê de li gorî celebê çolê zêdebûnek wusa dît (Hêjmara Pêvek. 13c, d, g, j, l, o, p). Frekansa arastekirina dabeşkirina şaneyê jî di mutantê çargoşe della de bandor bû, lê bi rêjeyek hindiktir ji mutantê monolîtîk della (Hêjmara Pêvek. 12d-f). Vê bandora dosageê, ligel nebûna bandorek li ser kulmê, pêşniyar dike ku çalakiya RGL3 ya mayî di mutantê çarcarî ya Della de guheztinên di meyla dabeşkirina hucreyê de ku ji ber windabûna çalakiya DELLA ve hatî çêkirin sînordar dike û ku guhertinên di dabeşên hucreyê yên alîgir de di bersivê de li şûna guhertinên di geometrîya SAM-ê de di çalakiya îşaretkirina GA de çê dibin. Wekî ku li jor hatî diyar kirin, pêşvebira CUC2 îfadeya IPR di SAM-ê de ji P4-ê dest pê dike (Hêjîra Pêvek. 14a, b) dimeşîne, û berevajî vê, pCUC2::gai-1-VENUS SAM xwedan mezinahîyek kêm, lê qelewbûnek bilindtir bû (Hêjîra Pêvek. 14c–h). Ev guhertina di morfolojiya pCUC2::gai-1-VENUS SAM de dibe ku bibe sedema belavbûnek cûda ya stresên mekanîkî li gorî celebê çolê, ku tê de tansiyonên derdorê yên bilind ji dûrek piçûktir ji navenda SAM dest pê dikin47. Alternatîf, guhertinên di morfolojiya pCUC2:: gai-1-VENUS SAM de dibe ku ji guheztinên taybetmendiyên mekanîkî yên herêmî yên ku ji hêla vegotina transgene ve têne çêkirin48 encam bidin. Di her du rewşan de, ev dikare bi zêdekirina îhtîmala ku şaneyên di çarçoveyek derdor / gerguhêz de parçe bibin, bandorên guhertinên di nîşana GA-yê de bi qismî berteref bike, çavdêriyên me rave dike.
Bi hev re, daneyên me piştrast dikin ku sînyala GA-ya bilind rolek çalak di rêgeziya paşîn a balafira dabeşkirina hucreyê de di IPR de dilîze. Di heman demê de ew destnîşan dikin ku kurbûna merîstemê di heman demê de bandorê li rêgeza dabeşkirina hucreyê li IPR jî dike.
Arasteya gerguhêz a balafira dabeşkirinê di IPR de, ji ber çalakiya bilind a îşaretkirina GA-yê, pêşniyar dike ku GA di nav SAM-ê de pelek hucreya radîkal pêş-organîze dike da ku rêxistina hucreyî ya ku dê paşê di navgîniya epidermal de were dîtin destnîşan bike. Bi rastî, pelên weha yên hucreyê bi gelemperî di wêneyên SAM-ê yên mutantên gerdûnî yên della de xuya bûn (Wêne. 6b). Ji ber vê yekê, ji bo ku em fonksiyona pêşkeftinê ya şêwaza fezayî ya sînyala GA-yê di SAM-ê de bêtir lêkolîn bikin, me wênekêşiya demdirêj bikar anî da ku rêxistina cîhê ya hucreyên di IPR-ê de di celeb-çovî (Ler û Col-0), mutantên gerdûnî yên della, û nebatên transgenîk pCUC2::gai-1-VENUS analîz bikin.
Me dît ku qmRGA destnîşan kir ku çalakiya îşaretkirina GA-yê di IPR-ê de ji P1/P2 zêde bû û di P4 de derket lûtkeyê, û ev nimûne bi demê re domdar ma (Hêjî. 4a–f û Hêjmara Pêvek. 8c–f, k). Ji bo analîzkirina organîzasyona cihî ya hucreyan di IPR de bi zêdebûna sînyala GA re, me hucreyên Ler IPR li jor û li aliyên P4 li gorî çarenûsa wan a pêşkeftinê ku 34 demjimêran piştî çavdêriya yekem hate analîz kirin, ango ji du caran plastîd zêdetir, bi me dide ku em di dema pêşkeftina primordiumê de ji P1/P2 heya P4 bişopînin şaneyên IPR. Me sê rengên cihêreng bikar anîn: zer ji bo wan şaneyên ku di nav primordyûmê de nêzî P4 bûn, kesk ji bo yên ku di IPR de bûn, û binefşî ji bo yên ku beşdarî her du pêvajoyan bûne (Hêjî. 7a-c). Li t0 (0 h), 1-2 qatên şaneyên IPR li ber P4 xuya bûn (Wêne. 7a). Wekî ku tê hêvîkirin, dema ku van şaneyan dabeş kirin, wan ew bi giranî bi riya balafira dabeşkirina gerguhêz (Hêl. 7a-c) kir. Encamên bi vî rengî bi karanîna Col-0 SAM (li ser P3, ku sînorê wê bi P4 re li Ler diqelişe) hatin bidestxistin, her çend di vê jenotîpê de qata ku li sînorê kulîlkan çêdibe şaneyên IPR zûtir vedişêre (Hêjî. 7g–i). Bi vî rengî, şêwaza dabeşkirina hucreyên IPR-ê hucreyan di nav rêzên radîkal de, wekî di navberan de, pêş-organîze dike. Rêxistinkirina rêzên radial û cîhkirina hucreyên IPR-ê di navbera organên li pey hev de destnîşan dike ku ev şaneyên pêşgirên navrû ne.
Li vir, me biosensorek nîşana GA-ya ratiometrîk, qmRGA, ku destûrê dide nexşeya mîqdar a çalakiya nîşana GA-yê ya ku ji berhevokên hevgirtî yên receptorên GA û GA-yê pêk tê, di heman demê de kêmkirina destwerdana rêyên nîşana endogenous, bi vî rengî agahdariya li ser fonksiyona GA-yê di asta hucreyî de peyda dike. Ji bo vê armancê, me proteînek DELLA-ya guhertî, mRGA, ava kir, ku şiyana girêdana hevalbendên danûstendina DELLA winda kiriye lê ji proteolîzasyona GA-ê-hilberkirî re hesas dimîne. qmRGA hem di astên GA-yê de hem ji guheztinên eksogenous û hem jî yên endojen re bersivê dide, û taybetmendiyên hestiyariya wê ya dînamîkî di dema pêşkeftinê de nirxandina guheztinên cihê-demî di çalakiya nîşankirina GA-yê de dike. qmRGA di heman demê de amûrek pir maqûl e ji ber ku ew dikare bi guheztina promotorê ku ji bo vegotina wê tê bikar anîn (heke hewce bike) ve were adapte kirin, û ji ber xwezaya parastî ya riya nîşana GA-yê û motîfa PFYRE di nav angiosperman de, îhtîmal e ku ew ji celebên din re were veguheztin22. Bi vê yekê re, mutasyonek wekhev a di proteîna SLR1 DELLA ya birincê (HYY497AAA) de jî hate destnîşan kirin ku çalakiya represorê ya mezinbûnê ya SLR1 ditepisîne di heman demê de ku tenê kêmbûna wê ya navbeynkar a GA-yê, mîna mRGA23, hinekî kêm dike. Nemaze, lêkolînên vê dawiyê yên li Arabidopsis destnîşan kirin ku mutasyonek amino asîdek yekane di qada PFYRE (S474L) de çalakiya veguheztinê ya RGA guhezand bêyî ku bandorê li kapasîteya wê bike ku bi hevkarên faktora transkrîpsiyonê50 re têkilî daynin. Her çend ev mutasyon pir nêzîkê 3 veguheztinên asîda amînî yên di mRGA de hene, lêkolînên me destnîşan dikin ku ev her du mutasyon taybetmendiyên cihêreng ên DELLA diguhezînin. Her çend piraniya hevkarên faktora transkripsiyonê bi qadên LHR1 û SAW yên DELLA26,51 ve girêdidin jî, hin asîdên amînî yên parastî yên di qada PFYRE de dibe ku alîkariya aramkirina van têkiliyan bikin.
Pêşveçûna internode di mîmariya nebat û başkirina berberiyê de taybetmendiyek bingehîn e. qmRGA çalakiya nîşana GA-ya bilindtir di hucreyên pêşerojê yên IPR-ê de eşkere kir. Bi berhevkirina wênekêşiya mîqdar û genetîk, me destnîşan kir ku qalibên nîşana GA-ê li ser pêlên dabeşkirina hucreyê ya dorhêl/gerguhêz li ser epîdermîsa SAM-ê vedihewîne, ku rêxistina dabeşkirina hucreyê ya ku ji bo pêşkeftina navberê hewce dike çêdike. Di dema pêşkeftinê de çend rêgezên rêgezên plana dabeşkirina hucreyê hatine nas kirin52,53. Xebata me mînakek zelal peyda dike ka çalakiya îşaretkirina GA çawa vê parametreya hucreyî bi rê ve dibe. DELLA dikare bi kompleksên proteîn ên pêşdibistanê41 re têkilî daynin, ji ber vê yekê îşaretkirina GA-ê dibe ku arastekirina balafira dabeşkirina hucreyê bi rasterast bandorkirina rêwerziya mîkrotubula kortîkal 40,41,54,55 verast bike. Me ji nişka ve nîşan da ku di SAM-ê de, pêwendiya çalakiya îşaretkirina GA-ya bilind ne dirêjbûn an dabeşbûna hucreyê bû, lê tenê anîsotropiya mezinbûnê bû, ku bi bandorek rasterast a GA-yê re li ser rêgeza dabeşkirina hucreyê di IPR de hevaheng e. Lêbelê, em nekarin ji holê rakin ku ev bandor di heman demê de nerasterast be, mînakî ji hêla nermbûna dîwarê hucreyê ya ku ji hêla GA ve hatî çêkirin56 ve tê navber kirin. Guhertinên di taybetmendiyên dîwarê hucreyê de stresa mekanîkî çêdike57,58, ku di heman demê de dikare bandorê li arastekirina plana dabeşkirina hucreyê bike bi bandorkirina rêgezên mîkrotubulên kortikal39,46,59. Bandorên hevgirtî yên stresa mekanîkî ya ku ji hêla GA-yê ve hatî çêkirin û rêziknameya rasterast a rêwerziya mîkrotubulê ji hêla GA ve dibe ku di afirandina şêwazek taybetî ya rêgezek dabeşkirina hucreyê de di IPR-ê de ji bo danasîna navbendan beşdar bibin, û ji bo ceribandina vê ramanê lêkolînên din hewce ne. Bi vî rengî, lêkolînên berê girîngiya proteînên TCP14 û 15-ê yên DELLA-têkildar di kontrolkirina damezrandina navgiran de ronî kirine60,61 û van faktoran dibe ku navbeynkariya çalakiya GA bi hev re bi BREVIPEDICELLUS (BP) û PENNYWISE (PNY), yên ku pêşkeftina navgirokê birêkûpêk dikin û nîşana GA22 verast dikin. Ji ber ku DELLA bi rêyên nîşankirinê re bi brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid, û acid abscisic (ABA) re têkilî dikin63,64 û ku ev hormon dikarin bandorê li rêgezkirina mîkrotubulê bikin65, dibe ku bandorên GA-yê li ser rêgezên dabeşkirina hucreyê jî ji hêla hormonên din ve were navber kirin.
Lêkolînên sîtolojîk ên destpêkê destnîşan kirin ku hem deverên hundur û yên derve yên Arabidopsis SAM ji bo pêşkeftina internode hewce ne2,42. Rastiya ku GA bi aktîvî dabeşkirina hucreyê di tevnên hundurîn de birêkûpêk dike12 fonksiyonek dualî ya GA-yê di rêzikkirina mezinahiya meristem û internode di SAM-ê de piştgirî dike. Nimûneya dabeşkirina hucreya rêgez di heman demê de di tevna hundurê SAM-ê de jî hişk tê rêve kirin, û ev rêzik ji bo mezinbûna stûnê pêdivî ye52. Dê balkêş be ku em lêkolîn bikin ka GA di heman demê de di organîzasyona hundurîn a SAM-ê de rolek di arastekirina balafirgeha dabeşkirina hucreyê de dilîze, bi vî rengî taybetmendî û pêşkeftina navberên di hundurê SAM-ê de hevdeng dike.
Nebat in vitro li axê an jî 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) ku bi 1% sukroz û 1% agar (Sigma) di bin şert û mercên standard de (ronahiya 16 saetan, 22 °C) lê hatiye zêdekirin, ji xeynî ceribandinên mezinbûna hîpokotîl û kok ku tê de şitil li ser lewheyên vertîkal 22 °C di bin ronahiya domdar de hatine mezin kirin. Ji bo ceribandinên nîtratê, nebat li ser navgîniya MS-ê ya guhertî (navîna nebatê ya bioWORLD) ku bi nîtrata têr (0 an 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinate, 1% sucrose û 1% A-agar (Sigma) di bin şert û mercên rojên dirêj de hatî zêdekirin, hatin mezin kirin.
GID1a cDNA ya ku di nav pDONR221 de hatî danîn bi pDONR P4-P1R-pUBQ10 û pDONR P2R-P3-mCherry ve di nav pB7m34GW de ji nû ve hate berhev kirin da ku pUBQ10::GID1a-mCherry çêbike. IDD2 ADN-ya ku di pDONR221-ê de hatî danîn di nav pB7RWG266 de ji nû ve hate berhev kirin da ku p35S:IDD2-RFP çêbike. Ji bo afirandina pGID1b:: 2xmTQ2-GID1b, parçeyek 3,9 kb ya jorîn a herêma kodkirina GID1b û parçeyek 4,7 kb ya ku cDNA-ya GID1b (1,3 kb) û termînator (3,4 kb) vedihewîne, pêşî bi karanîna primerên di Tabloya Pêvek de P-Rmo4 û paşêONR-ya Pêvek hate zêdekirin (P-Rmo4-ê û paşê ONR di p3 û P-R1-ê de hate zêdekirin). Fisher Scientific) û pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), bi rêzê ve, û di dawiyê de bi pDONR221 2xmTQ268 di vektora armancê ya pGreen 012567 de bi karanîna klonkirina Gateway ve hatî hevber kirin. Ji bo hilberîna pCUC2:: LSSmOrange, rêzika promotorê CUC2 (3229 bp li jora ATG) li dûv rêza kodkirina mOrange-ya mezin a Stokes-guhertî (LSSmOrange) 69 bi sînyala herêmîkirina nukleerî ya N7 û termînatora transkrîpsiyonê ya NOS-ê bi karanîna vekêşana G-ê ve hatî berhev kirin û bi karanîna vekêşana G-ê ve hatî berhev kirin. Pergala rekombînasyona 3-parçeyan (Invitrogen). Vektora binar a nebatê bi rêzê bi rêbaza înfiltrasyonê ya Agrobacterium û di nav Arabidopsis thaliana Col-0 de bi rêbaza dilopkirina kulîlkan ket nav Agrobacterium tumefaciens çenga GV3101 û kete nav pelên Nicotiana benthamiana. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry û pCLV3::mCherry-NLS qmRGA, bi rêzê, ji nifşên F3 û F1 yên xaçên rêzdar hatin veqetandin.
RNA di cih de hîbrîdîzasyona li ser tîrêjên guliyên bi qasî 1 cm dirêj72 hate kirin, ku hatin berhev kirin û tavilê di çareseriya FAA de (3,7% formaldehyde, 5% asîda acetîk, 50% etanol) ku berê di 4 °C de hatî sar kirin, hate sax kirin. Piştî dermankirinên valahiya 2 × 15 hûrdem, fîksatîf hate guheztin û nimûne di şevekê de hatin inkub kirin. CDNA-yên GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, û RGL3 û sondajên antîsensê yên 3'-UTR-ên wan bi karanîna primerên ku di Tabloya Pêvek 3 de hatine destnîşan kirin wekî ku ji hêla Rosier et al.73 ve hatî destnîşan kirin hatine sentez kirin. Lêpirsînên bi etîketkirî yên digoxigenin bi karanîna antîbozên digoxigenin (3000 qat rijandin; Roche, jimareya katalogê: 11 093 274 910) immunodetekt kirin, û beş bi 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfate (BCIP-indolyl phosphate / BCIP, 093 274 910) hatin xemilandin. Çareseriya (NBT, 200-qatî helandinê).
Dema şandinê: Reşem-10-2025