Nematodê çamê endoparazîtek koçber a karantîn e ku tê zanîn ku di ekosîstemên daristanên çamê de dibe sedema zirarên aborî yên giran. Lêkolîna heyî çalakiya nematîkî ya îndolên halojenkirî li dijî nematodên pine û mekanîzmaya çalakiya wan dinirxîne. Çalakiyên nematicîdal ên 5-iodoindole û avermectin (kontrola erênî) li dijî nematodên pine wekhev û bilind bûn di hûrgelên nizm de (10 μg / mL). 5-iodoindole fêkîbûn, çalakiya hilberîneriyê, mirina embryonîk û larval, û tevgera lokomotor kêm kir. Têkiliyên molekulî yên lîgandan bi receptorên kanala klorîdê yên glutamate-dergarkirî yên nevertebrate re piştgirî didin vê têgînê ku 5-iodoindole, mîna avermectin, bi cîhê çalak a receptorê re hişk girêdide. 5-Iodoindol di heman demê de di nematodan de deformasyonên fenotîpîk ên cihêreng, di nav de hilweşîn / piçûkbûna organên nenormal û zêdekirina vakuolîzasyonê jî vedihewîne. Van encaman destnîşan dikin ku vakuol dibe ku di mirina bi navbeynkariya metilasyonê ya nematodê de rolek bilîzin. Ya girîng, 5-iodoindole ji her du celebên nebatan (kelem û tîrêjê) ne jehrî bû. Bi vî rengî, ev lêkolîn destnîşan dike ku serîlêdana iodoindole di bin şert û mercên hawîrdorê de dikare zirara zuwabûna pine kontrol bike.
Nematodên dara çamê (Bursaphelenchus xylophilus) ji nematodên dara çamê (PWN) ye, nematodên endoparazît ên koçber ên ku têne zanîn ku zirarek giran a ekolojîk li ekosîstemên daristanên çamê dihêlin1. Nematod dara çamê (PWD) ku ji ber nematodê dara çamê çêdibe, li gelek parzemînan, di nav de Asya û Ewropa, dibe pirsgirêkek cidî, û li Amerîkaya Bakur, nematod cureyên hinarê yên naskirî tune dike1,2. Kêmbûna dara çamê pirsgirêkek aborî ya mezin e, û perspektîfa belavbûna wê ya cîhanî fikar e3. Cureyên hinarê yên jêrîn herî zêde rastî êrîşa nematodê tên: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, û Pinus radiata4. Nematodê çamê nexweşiyek cidî ye ku dikare darên çamê di nav hefte an mehan de ji enfeksiyonê bikuje. Wekî din, derketinên nematodên çamê di cûrbecûr ekosîsteman de hevpar in, ji ber vê yekê zincîrên enfeksiyonê yên domdar hatine damezrandin1.
Bursaphelenchus xylophilus nematodeke karantîn a nebat-parazît e ku ji malbata super Aphelenchoidea û clade 102.5 e. Nematod bi kêzikan dixwe û di nav tevnên dar ên darên çamê de zêde dibe, di çar qonaxên larvalê yên cihêreng de çêdibe: L1, L2, L3, L4 û kesek mezin1,6. Di bin şert û mercên kêmbûna xwarinê de, nematodê çamê derbasî qonaxek larvakî ya pispor - dauer dibe, ku vektora xwe - kêzika çamê (Monochamus alternatus) parazît dike û vediguhezîne darên çamê yên saxlem. Di mêvandarên saxlem de, nematod zû di nav tevnên nebatan de koç dikin û li ser şaneyên parenkîmatoz dixwin, ku ev yek dibe sedema hejmarek reaksiyonên hestiyariyê, ziwabûna çamê û mirinê di nav salekê de piştî enfeksiyonê1,7,8.
Kontrolkirina biyolojîkî ya nematodên çamê demek dirêj dijwariyek e, digel tedbîrên karantînê ku ji sedsala 20-an vedigere. Stratejiyên heyî yên ji bo kontrolkirina nematodên çamê di serî de tedbîrên kîmyewî, di nav de fumîgkirina darê û danîna nematîkîdên nav qurmên daran. Nematicîdên ku herî zêde têne bikar anîn avermectin û avermectin benzoate ne, ku ji malbata avermectin in. Van kîmyewî yên biha li hember gelek celebên nematode pir bi bandor in û ji hêla jîngehê ve ewle têne hesibandin9. Lêbelê, karanîna dubare ya van nematîkan tê çaverê kirin ku zexta hilbijartinê biafirîne ku hema hema bê guman dê bibe sedema derketina nematodên çamê yên berxwedêr, wekî ku ji bo çend kêzikên kêzikan hatî destnîşan kirin, wek Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella û nematodên Trichostrongylus colubriformis û Ostertagia ku hêdî hêdî berxwedêriya kêzikan pêş xistine, avermectins10,11,12. Ji ber vê yekê, pêdivî ye ku şêwazên berxwedanê bi rêkûpêk bêne lêkolîn kirin û nematicîdan bi domdarî bêne kontrol kirin da ku ji bo kontrolkirina PVD tedbîrên alternatîf, lêçûn-bandor û hawirdorê bibînin. Di dehsalên dawî de, hejmarek nivîskaran pêşniyara karanîna ekstraktên nebatan, rûnên bingehîn û avjeniyan wekî ajanên kontrolkirina nematodê kirine13,14,15,16.
Me vê dawiyê çalakiya nematicîdal a îndolê, molekulek îşaretek navxaneyî û navbirî, li Caenorhabditis elegans 17 nîşan da. Indole di ekolojiya mîkrobial de îşaretek hundurînek berbelav e, gelek fonksiyonên ku bandorê li fîzyolojiya mîkrobial, damezrandina spore, aramiya plasmîd, berxwedana derman, damezrandina biyofilmê, û zerarbûnê dike, kontrol dike 18, 19. Çalakiya indole û derûvên wê li dijî nematodên pathogenîk ên din nehatiye lêkolîn kirin. Di vê lêkolînê de, me çalakiya nematîkî ya 34 îndolan li dijî nematodên çamê lêkolîn kir û mekanîzmaya çalakiya 5-iodoindolê ya herî bi hêz bi karanîna mîkroskopî, wênekêşiya demdirêj, û ceribandinên dorpêkirina molekulî ronî kir, û bandorên wê yên jehrîn li ser nebatan bi karanîna ceribandinek germbûna tovê nirxand.
Berê li ser nematodes17 tansiyonên bilind (> 1.0 mM) yên îndolê hatine ragihandin ku bandorek nematicîdal heye. Piştî dermankirina B. xylophilus (qonaxên jiyana tevlihev) bi îndol an 33 jêderkên cuda yên îndolê di 1 mM de, mirina B. xylophilus bi jimartina nematodên zindî û mirî di komên kontrol û dermankirî de hate pîvandin. Pênc indoles çalakiya nematîkî ya girîng nîşan dan; zindîbûna koma kontrolê ya nehatî dermankirin piştî 24 demjimêran %95 ± 7 bû. Ji 34 indolên hatine ceribandin, 5-iodoindole û 4-fluoroindole di 1 mM de bûne sedema 100% mirinê, lê 5,6-difluoroindigo, methylindole-7-carboxylate, û 7-iodoindole bûne sedema hema hema 50% mirinê (Table 1).
Bandora 5-iodoindole li ser damezrandina vakuol û metabolîzma nematodê darikê çamê. (A) Bandora avermectin û 5-iodoindole li ser nematodên nêr ên mezin, (B) hêkên nematodê yên qonaxa L1 û (C) metabolîzma B. xylophilus, (i) vakuol di 0 saetan de nehatin dîtin, dermankirin di encamê de (ii) vakuol, (iii) kombûna vakuolan, (iii) kombûna vakuolê, (iii) kombûna vakuolê, (iii) berhevkirina vakuolê, (iii) kombûna vakuolê (iii) vakuolên B. xylophilus. hevgirtina vakuolan û (vi) çêbûna vakuolên mezin. Tîrên sor werimîna vakuolan, tîrên şîn hevbûna vakuolan û tîrên reş jî vakuolên mezin nîşan didin. Bara pîvanê = 50 μm.
Wekî din, vê lêkolînê di heman demê de pêvajoyek rêzdar a mirina ku ji metanê ve hatî çêkirin di nematodên pine de jî diyar kir (Wêne 4C). Mirina metanogenîk celebek ne-apoptotîk a mirina şaneyê ye ku bi kombûna vakuolên sîtoplazmî yên berbiçav ve girêdayî ye27. Kêmasiyên morfolojîk ên ku di nematodên pine de têne dîtin xuya dikin ku ji nêz ve bi mekanîzmaya mirina ji ber metanê ve girêdayî ne. Muayeneya mîkroskopî ya di demên cûda de destnîşan kir ku vakuolên giant piştî 20 demjimêran ji rûxandina 5-iodoindole (0.1 mM) hatine çêkirin. Vakuolên mîkroskopî piştî dermankirinê 8 demjimêran hatin dîtin, û piştî 12 demjimêran hejmara wan zêde bû. Piştî 14 saetan çend vakuolên mezin hatin dîtin. Gelek vakuolên hevgirtî piştî 12-16 demjimêran ji dermankirinê bi zelalî xuya bûn, ku destnîşan dike ku hevgirtina vakuolê bingeha mekanîzmaya mirina metanogenîk e. Piştî 20 saetan, gelek vakuolên mezin li seranserê kurmê hatin dîtin. Van çavdêriyan yekem rapora metuosis li C. elegans temsîl dikin.
Di kurmên ku bi 5-iodoindole ve hatî derman kirin de, kombûna vakuolê û şikestin jî hate dîtin (Hêjî. 5), wekî ku ji hêla kulbûna kurm û berdana vakuolê ve li hawîrdorê tê xuyang kirin. Di parzûna hêkê de jî qutbûna vakuolê hate dîtin, ku bi gelemperî ji hêla L2-ê ve di dema helandinê de saxlem tê parastin (Hêjîra pêvek. S2). Van çavdêriyan tevlêbûna berhevkirina şilavê û têkçûna osmoregulatory, û hem jî birîna şaneya vegerî (RCI), di pêvajoya damezrandina vakuolê û şilbûnê de piştgirî dikin (Hêjî. 5).
Hîpotezkirina rola iyotê di avakirina vakuolê ya dîtbar de, me çalakiya nematicîdal a iodide sodyûm (NaI) û iodide potassium (KI) lêkolîn kir. Lêbelê, di tansiyonê de (0.1, 0.5 an 1 mM), wan bandor li ser zindîbûna nematodê an jî damezrandina vakuolê nekiriye (Hêjîra Pêvek. S5), her çend 1 mM KI xwedan bandorek nematîkî ya sivik bû. Ji hêla din ve, 7-iodoindole (1 an 2 mM), mîna 5-iodoindole, gelek vakuol û deformasyonên strukturel derdixe holê (Hêjmara Pêvek. S6). Du iodinondoles di nematodên pine de taybetmendiyên fenotîpîkî yên wekhev nîşan dan, lê NaI û KI ne. Balkêş e, ku îndole di B. xylophilus de di tansiyonên ceribandin (daneyên ku nehatine xuyang kirin) de avakirina vakuolê çênekir. Bi vî rengî, encaman piştrast kir ku kompleksa îndol-îyotê ji vakuolîzasyon û metabolîzma B. xylophilus berpirsiyar e.
Di nav indolên ku ji bo çalakiya nematicîdal hatine ceribandin, 5-iodoindole xwedan nîşaneya herî bilind a -5.89 kcal/mol bû, li pey 7-iodoindole (-4.48 kcal/mol), 4-fluoroindole (-4.33), û indole (-4.03) (Şikl ). Girêdana hîdrojenê ya piştê ya bihêz a 5-iodoindole bi leucine 218 ve girêdana wê stabîl dike, lê hemî derûvên din ên indolê bi serine 260 ve bi girêdanên hîdrojenê yên zincîra alî ve girêdidin. Di nav iodoindolên din ên modelkirî de, 2-iodoindole xwedî nirxa girêdanê ya -5,248 kcal/mol e, ku ev yek ji ber girêdana wê ya hîdrojenê ya sereke bi leucine 218 re ye. Girêdanên din ên naskirî 3-iodoindole (-4,3 kcal/mol), 4-iodoindole (-4,0-fluorool), û 6,0 flundool/6, û kcal/mol) (Hêjmara Pêvek S8). Piraniya îndolên halojenkirî û îndol bi xwe, ji bilî 5-iodoindole û 2-iodoindole, bi serine 260 re têkiliyek çêdikin. Rastiya ku girêdana hîdrojenê bi leucine 218 ve girêdayî girêdana receptor-lîgand a bikêr e, wekî ku ji bo ivermectin tê dîtin (Supplementary Fig. 2-iodoindol, mîna ivermectin, bi riya leucine 218 bi cîhê çalak ê receptora GluCL ve girêdide (Wêne. 6 û Hêjmara Pêvek. S8). Em pêşniyar dikin ku ev girêdan ji bo domandina avahiya pora vekirî ya kompleksa GluCL hewce ye û ew bi hişk girêdana bi cîhê çalak a receptorê GluCL, 5-iodoindole, 2-iodoindole, avermectin û ivermectin re pêdivî ye ku bi vî rengî kanala îonê vekirî bimîne û rê bide girtina şilavê.
Girêdana molekulî ya îndol û îndola halojenkirî ji GluCL re. Arasteyên girêdana (A) indol, (B) 4-fluoroindol, (C) 7-iodoindole, û (D) lîgandên 5-iodoindol bi cîhê çalak ê GluCL re. Proteîn bi rîbonek tê temsîl kirin, û bendên hîdrojenê yên piştê wekî xetên xalîçeyên zer têne xuyang kirin. (A'), (B'), (C'), û (D') danûstendinên lîgandên têkildar bi bermayiyên asîda amînî yên derdorê re nîşan didin, û bendên hîdrojenê yên zincîra alî bi tîrên xalîçeyên pembe têne destnîşan kirin.
Ceribandin ji bo nirxandina bandora toksîkî ya 5-iodoindole li ser germbûna tovên kelem û tîrêjê hatin kirin. 5-iodoindole (0,05 an 0,1 mM) an avermectin (10 μg / mL) bandorek hindik an jî tune li ser germbûna destpêkê û derketina nebatan hebû (Wêne 7). Wekî din, ti cûdahiyek girîng di navbera rêjeya germbûna kontrolên nehatî dermankirin û tovên ku bi 5-iodoindol an avermectin têne derman kirin de nehat dîtin. Bandora li ser dirêjbûna tîrêjê û hejmara rûkên paşîn ên ku hatine çêkirin ne girîng bû, her çend 1 mM (10 qat qatbûna wê ya çalak) 5-iodoindol hinekî pêşkeftina rehên paşîn dereng xist. Van encaman destnîşan dikin ku 5-iodoindole ji hucreyên nebatê re ne jehrî ye û di pêvajoyên geşepêdana nebatê de di hûrguliyên ku hatine xwendin de destwerdanê nake.
Bandora 5-iodoindole li ser germbûna tovan. Germikbûn, şînbûn û rehên alîkî yên tovên B. oleracea û R. raphanistrum li ser navgîna Murashige û Skoog agar bi an bê avermectin an 5-iodoindole. Germbûn piştî 3 rojên înkubasyonê di 22°C de hate tomar kirin.
Vê lêkolînê gelek bûyerên kuştina nematode ji hêla indoles ve rapor dike. Ya girîng, ev yekem rapor e ku îdoindolê metîlasyonê çêdike (pêvajoyek ku ji berhevkirina vakuolên piçûk ên ku hêdî hêdî di nav vakuolên giyanî de diqewime, di dawiyê de dibe sedema şikestin û mirina perdeyê) di derziyên çamê de, digel ku iodoindole taybetmendiyên nematîkî yên girîng ên mîna yên nematicîda bazirganî ya avermect nîşan dide.
Berê hatibû ragihandin ku Indoles di prokaryotes û eukaryotan de gelek fonksiyonên nîşankirinê didin, di nav de astengkirin / damezrandina biyofilmê, zindîbûna bakteriyan, û pathogenicity19,32,33,34. Di van demên dawî de, bandorên dermankirinê yên potansiyel ên îndolên halojenkirî, alkaloidên îndol, û derûvên îndolê yên nîvsentetîkî bala lêkolînê ya berfireh kişandiye35,36,37. Mînakî, îndolên halojenkirî hatine xuyang kirin ku hucreyên Escherichia coli û Staphylococcus aureus domdar dikujin37. Wekî din, lêkolîna bandora îndolên halojenkirî li dijî cureyên din, cins û padîşahiyên din balkêş e û ev lêkolîn ji bo gihîştina vê armancê gavek e.
Li vir, em mekanîzmayek ji bo kuştina 5-iodoindol-ê di C. elegans-ê de li ser bingeha birîna hucreya veguhezbar (RCI) û metilasyonê (Wêneyên 4C û 5) pêşniyar dikin. Guhertinên edematous ên wekî puffiness û dejenerasyona vakuolê nîşaneyên RCI û metilasyonê ne, ku di sîtoplazmayê de wekî vakuolên mezin têne xuyang kirin48,49. RCI bi kêmkirina hilberîna ATP, dibe sedema têkçûna pompeya ATPase, an têkbirina membranên hucreyê û dibe sedema ketina bilez a Na+, Ca2+, û avê50,51,52, hilberîna enerjiyê asteng dike. Vakuolên intrasîtoplazmî di şaneyên ajalan de di encama kombûna şilekê di sîtoplazmayê de ji ber hatina Ca2+ û avê53 çêdibin. Balkêş e ku ev mekanîzmaya zirara şaneyê ger zirar demkî be û şaneyên ji bo demek diyarkirî dest bi hilberîna ATP-ê bikin veger e, lê heke zirar bidome an xirabtir bibe, xaneyên dimirin.54 Çavdêriyên me destnîşan dikin ku nematodên ku bi 5-iodoindole têne derman kirin piştî ku ketine ber şert û mercên stresê nikarin biosenteza normal vegerînin.
Fenotîpa metilasyonê ya ku ji hêla 5-iodoindole ve di B. xylophilus de hatî çêkirin dibe ku ji ber hebûna îyotê û belavkirina wê ya molekulî be, ji ber ku 7-iodoindole li ser B. xylophilus ji 5-iodoindole kêmtir bandorek mêtînger hebû (Table 1 û Figure Pêvek S6). Ev encam bi lêkolînên Maltese et al. (2014), yê ku ragihand ku veguheztina nîvê nîtrojena pyridyl di indolê de ji para- ber bi meta-pozîsyonê vakuolîzasyon, astengkirina mezinbûnê, û cytotoxicity di hucreyên U251 de betal kir, pêşniyar dike ku pêwendiya molekulê bi cîhek çalak a taybetî re di proteînê de krîtîk e25,44,4. Têkiliyên di navbera indole an îndolên halojenkirî û receptorên GluCL de ku di vê lêkolînê de hatine dîtin jî vê têgînê piştgirî dikin, ji ber ku 5- û 2-iodoindole ji hindolên din ên ku hatine vekolandin bi hêztir bi receptorên GluCL ve girêdide (Wêne 6 û Figure Pêvek S8). Iyot di pozîsyona duyemîn an pêncemîn a îndolê de hate dîtin ku bi leucine 218 ya receptora GluCL ve bi girêdanên hîdrojenê yên piştê ve girêdide, lê hindolên halojenkirî yên din û îndol bixwe bi serine 260 re girêdanên hîdrojenê yên zincîra alî-qels ava dikin (Wêne 6). Ji ber vê yekê em texmîn dikin ku herêmîkirina halojenê di vekêşana dejenerasyona vakuolê de rolek girîng dilîze, di heman demê de girêdana hişk a 5-iodoindole kanala îonê vekirî dihêle, bi vî rengî rê dide herikîna şilavê ya bilez û qutbûna vakuolê. Lêbelê, mekanîzmaya berbiçav a çalakiyê ya 5-iodoindol dimîne ku were destnîşankirin.
Berî sepana pratîkî ya 5-iodoindol, divê bandora wê ya toksîkî li ser nebatan were analîz kirin. Tecrûbeyên me yên germbûna tovê nîşan da ku 5-iodoindole di kêşeyên ku hatine lêkolîn kirin de bandorek neyînî li ser germbûna tov an pêvajoyên pêşkeftina paşîn tune (Wêne 7). Bi vî rengî, ev lêkolîn bingehek ji bo karanîna 5-iodoindole di hawîrdora ekolojîk de peyda dike da ku zirara nematodên çamê li darên çamê kontrol bike.
Raporên berê destnîşan kirin ku terapiya li ser bingeha îndolê rêgezek potansiyel nîşan dide ku pirsgirêka berxwedana antîbiyotîk û pêşkeftina penceşêrê çareser bike55. Wekî din, indoles xwedî çalakiyên antîbakterî, antîpenceşêr, antîoksîdan, antî-înflamatuar, antîdiabetîk, antîviral, antîproliferatîf û antîtuberkulozê ne û dibe ku ji bo pêşkeftina dermanan bibe bingehek hêvdar56,57. Ev lêkolîn ji bo yekem car karanîna potansiyela iyotê wekî antîparazît û anthelmintîk pêşniyar dike.
Avermectin sê deh sal berê hate keşif kirin û di sala 2015-an de Xelata Nobelê wergirt, û karanîna wê wekî anthelmîntîk hîn jî bi rengek çalak berdewam e. Lêbelê, ji ber pêşkeftina bilez a berxwedana li hember avermectins di nematodes û kêzikên kêzikan de, ji bo kontrolkirina enfeksiyona PWN di darên çamê de stratejiyek alternatîf, kêm-mesref û hawirdorê hewce ye. Ev lêkolîn di heman demê de mekanîzmaya ku 5-iodoindole nematodên çamê dikuje jî radigihîne û ku 5-iodoindole ji şaneyên nebatê re xwedan toksîtiyek kêm e, ku ji bo serîlêdana wê ya bazirganî ya pêşerojê perspektîfên baş vedike.
Hemî ceribandin ji hêla Komîteya Ethîkê ya Zanîngeha Yeungnam, Gyeongsan, Koreya ve hatî pejirandin, û rêbaz li gorî rêwerzên Komîteya Ethîkê ya Zanîngeha Yeungnamê hatine kirin.
Ezmûnên înkubasyona hêkan bi rêbazên damezrandî hatin kirin43. Ji bo nirxandina rêjeyên hilkişînê (HR), nematodên mezin ên 1-rojî (nêzîkî 100 mê û 100 nêr) hatin veguheztin bo firaqên Petri yên ku fungus tê de hene û destûr dan ku 24 demjimêran mezin bibin. Dûv re hêk hatin veqetandin û bi 5-iodoindole (0,05 mM û 0,1 mM) an avermectin (10 μg/ml) wekî suspensionê di ava distîlkirî ya sterîl de hatin derman kirin. Van suspensions (500 μl; nêzîkê 100 hêk) hatin veguheztin bo bîrên plakaya çanda tevnvîsê ya 24-kanî û di 22 °C de hatin înkubakirin. Jimartina L2 piştî 24 demjimêran ji înkubasyonê hate çêkirin, lê heke hucre nelive gava ku bi têlek platînumê xweş were teşwîq kirin mirî têne hesibandin. Ev ceribandin di du qonaxan de, her yek bi şeş dubareyan hate kirin. Daneyên her du ceribandinan hatin berhev kirin û pêşkêş kirin. Rêjeya HR bi vî rengî tê hesibandin:
Mirina larvalan bi karanîna prosedurên ku berê hatine pêşve xistin hate nirxandin. Hêkên nematodê hatin komkirin û embriyo bi helandina di ava sterilkirî ya sterîl ve hatin hevdem kirin da ku kurmikên qonaxa L2 çêbikin. Kurmikên hevdemkirî (nêzîkî 500 nematodes) bi 5-iodoindole (0,05 mM û 0,1 mM) an avermectin (10 μg/ml) hatin dermankirin û li ser lewheyên B. cinerea Petri hatin mezin kirin. Piştî 48 demjimêran ji înkubasyonê li 22 °C, nematodes di ava distîlkirî ya sterîl de hatin berhev kirin û ji bo hebûna qonaxên L2, L3, û L4 têne lêkolîn kirin. Hebûna qonaxên L3 û L4 veguherîna larval nîşan dide, lê hebûna qonaxa L2 veguherînek nîşan nade. Wêneyên bi karanîna Pergala Nîgarkêşiya Hucreya Dîjîtal a iRiS™ hatin girtin. Ev ceribandin di du qonaxan de, her yek bi şeş dubareyan hate kirin. Daneyên her du ceribandinan hatin berhev kirin û pêşkêş kirin.
Zehrîbûna 5-iodoindole û avermectin ji tovan re bi testên germbûnê yên li ser lewheyên Murashige û Skoog agar hate nirxandin. hîpochlorite sodyûm) ji bo 15 min, û pênc caran bi 1 ml ava steril şuştin. Dûv re tovên sterilîzekirî li ser lewheyên agar ên germbûnê yên ku tê de 0,86 g/l (0,2X) navgîniya Murashige û Skoog û 0,7% agar bakterîolojîk bi 5-iodoindole an avermectin an bêyî wan ve hatî vegirtin, hatin kişandin. Dûv re lewh di 22 °C de hatin înkubakirin, û piştî 3 roj inkubasyonê wêne hatin kişandin. Ev ceribandin di du qonaxan de, ku her yek ji wan şeş dubare bûn, hate kirin.
Dema şandinê: Feb-26-2025