Nematoda çamê endoparazîtek koçber a karantînayê ye ku tê zanîn ku dibe sedema windahiyên aborî yên giran di ekosîstemên daristanên çamê de. Ev lêkolîn çalakiya nematîsîd a îndolên halojenkirî li dijî nematodên çamê û mekanîzmaya çalakiya wan dinirxîne. Çalakiyên nematîsîd ên 5-îyodoîndol û avermektîn (kontrola erênî) li dijî nematodên çamê di heman rengî û di konsantrasyonên nizm de bilind bûn (10 μg/mL). 5-îyodoîndol berhemdarî, çalakiya hilberandinê, mirina embrîyonîk û larvayê, û tevgera tevgerê kêm kir. Têkiliyên molekulî yên lîgandan bi receptorên kanala klorîdê yên glutamate-dergehkirî yên taybetî yên bêvertebratan re piştgirî didin wê ramanê ku 5-îyodoîndol, mîna avermektîn, bi zexmî bi cîhê çalak ê receptor ve girêdide. 5-îyodoîndol di nematodan de deformasyonên fenotipîk ên cûrbecûr jî çêkir, di nav de hilweşîna/çûkbûna organên anormal û zêdebûna vakûolîzasyonê. Ev encam nîşan didin ku vakûol dikarin di mirina bi navbeynkariya metîlasyona nematodê de rolek bilîzin. Girîng e ku 5-îyodoîndol ji bo her du cureyên nebatan (kelem û tirşik) ne-jehrîn bû. Bi vî awayî, ev lêkolîn nîşan dide ku sepandina îyodoîndolê di bin şert û mercên hawîrdorê de dikare zirara zuwabûna çaman kontrol bike.
Nematoda dara çamê (Bursaphelenchus xylophilus) yek ji nematodên dara çamê (PWN) ye, nematodên endoparazît ên koçber ku bi zirara ekolojîk a giran li ekosîstemên daristana çamê têne zanîn1. Nexweşiya şilbûna çamê (PWD) ku ji hêla nematoda dara çamê ve çêdibe, li gelek parzemînan, di nav de Asya û Ewropa, dibe pirsgirêkek cidî, û li Amerîkaya Bakur, nematod cureyên çamên hatine anîn ji holê radike1,2. Kêmbûna darên çamê pirsgirêkek mezin a aborî ye, û perspektîfa belavbûna wê ya gerdûnî xemgîn e3. Cureyên çamên jêrîn bi gelemperî ji hêla nematodê ve têne êrîş kirin: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, û Pinus radiata4. Nematoda çamê nexweşiyek cidî ye ku dikare darên çamê di nav çend hefteyan an mehan de piştî enfeksiyonê bikuje. Wekî din, belavbûna nematodên çamê di cûrbecûr ekosîsteman de gelemperî ye, ji ber vê yekê zincîrên enfeksiyonê yên domdar hatine damezrandin1.
Bursaphelenchus xylophilus nematodek parazît a nebatan a karantînayê ye ku ji supermalbata Aphelenchoidea û klada 102.5 pêk tê. Nematod bi fungî xwe dixwe û di tevnên darên çaman de zêde dibe, di çar qonaxên larvayê yên cûda de pêş dikeve: L1, L2, L3, L4 û takekesek mezin1,6. Di şert û mercên kêmbûna xwarinê de, nematoda çaman derbasî qonaxek larvayê ya taybetî dibe - dauer, ku vektorê xwe - kêzika qalikê çaman (Monochamus alternatus) parazît dike û vediguhezîne darên çaman ên saxlem. Di mêvandarên saxlem de, nematod bi lez di nav tevnên nebatan re koç dikin û bi şaneyên parenkîmatoz dixwin, ku dibe sedema hejmarek reaksiyonên hesasiyetê, ziwabûna çaman û mirina wan di nav salekê de piştî enfeksiyonê1,7,8.
Kontrolkirina biyolojîk a nematodên çamê demek dirêj e ku dijwar e, tedbîrên karantînayê vedigerin sedsala 20-an. Stratejiyên heyî ji bo kontrolkirina nematodên çamê bi giranî dermankirinên kîmyewî vedihewîne, di nav de fûmîgasyona dar û çandina nematîsîdên nav qurmên daran. Nematîsîdên herî zêde têne bikar anîn avermektîn û benzoata avermektîn in, ku ji malbata avermektîn in. Ev kîmyewiyên biha li dijî gelek cureyên nematodan pir bi bandor in û wekî ewle ji bo jîngehê têne hesibandin9. Lêbelê, tê payîn ku karanîna dubare ya van nematîsîdên ku zexta hilbijartinê çêbike ku hema hema bê guman dê bibe sedema derketina nematodên çamê yên berxwedêr, wekî ku ji bo çend kêzikên zirardar, wekî Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella û nematodên Trichostrongylus colubriformis û Ostertagia circumcincta, ku hêdî hêdî berxwedan li hember avermektînan pêş xistine, hatiye nîşandan10,11,12. Ji ber vê yekê, pêdivî ye ku şêwazên berxwedanê bi rêkûpêk werin lêkolîn kirin û nematîsîd bi berdewamî werin kontrol kirin da ku tedbîrên alternatîf, lêçûn-bandor û jîngehparêz ji bo kontrolkirina PVD werin dîtin. Di dehsalên dawî de, hejmarek nivîskaran pêşniyar kirine ku ekstraktên nebatan, rûnên bingehîn û madeyên firal wekî ajanên kontrolkirina nematodan werin bikar anîn13,14,15,16.
Me vê dawiyê çalakiya nematîsîd a îndolê, molekulek sînyala nav-hucreyî û nav-padîşahî, di Caenorhabditis elegans de nîşan da 17. Îndol di ekolojiya mîkrobî de sînyalek nav-hucreyî ya berbelav e, ku gelek fonksiyonên ku bandorê li fîzyolojiya mîkrobî, çêbûna sporê, aramiya plazmîdê, berxwedana dermanan, çêbûna biyofîlmê û virulansê dikin kontrol dike 18, 19. Çalakiya îndolê û derivatîfên wê li dijî nematodên din ên patogenîk nehatiye lêkolîn kirin. Di vê lêkolînê de, me çalakiya nematîsîd a 34 îndolê li dijî nematodên çamê lêkolîn kir û mekanîzmaya çalakiya 5-îyodoîndolê ya herî bihêz bi karanîna mîkroskopiyê, wênekêşiya demkî û ceribandinên docking molekulî ronî kir, û bandorên wê yên jehrî li ser nebatan bi karanîna ceribandina geşbûna tovan nirxand.
Berê hatiye ragihandin ku rêjeyên bilind (>1.0 mM) yên îndolê bandorek nematosîdê li ser nematodan dikin17. Piştî dermankirina B. xylophilus (qonaxên jiyanê yên tevlihev) bi îndol an 33 derivatîfên cûda yên îndolê bi 1 mM, mirina B. xylophilus bi jimartina nematodên zindî û mirî di komên kontrol û dermankirî de hate pîvandin. Pênc îndolê çalakiya nematosîdê ya girîng nîşan dan; saxmayîna koma kontrolê ya bê dermankirin piştî 24 demjimêran 95 ± 7% bû. Ji 34 îndolên ku hatine ceribandin, 5-îyodoîndol û 4-fluoroîndol di 1 mM de bûne sedema mirina 100%, lê 5,6-dîfluoroîndîgo, metîlîndol-7-karboksîlat, û 7-îyodoîndol bûne sedema mirina bi qasî 50% (Tabloya 1).
Bandora 5-îyodoîndolê li ser çêbûna vakuolan û metabolîzma nematoda dara çamê. (A) Bandora avermektîn û 5-îyodoîndolê li ser nematodên nêr ên mezin, (B) hêkên nematoda qonaxa L1 û (C) metabolîzma B. xylophilus, (i) di 0 demjimêran de vakuol nehatin dîtin, dermankirinê bû sedema (ii) vakuolan, (iii) kombûna gelek vakuolan, (iv) werimîna vakuolan, (v) yekbûna vakuolan û (vi) çêbûna vakuolên mezin. Tîrên sor werimîna vakuolan nîşan didin, tîrên şîn yekbûna vakuolan nîşan didin û tîrên reş vakuolên mezin nîşan didin. Pîvana xêz = 50 μm.
Herwiha, vê lêkolînê pêvajoya li pey hev a mirina ji ber metanê di nematodên çamê de jî rave kir (Wêne 4C). Mirina metanogenîk cureyek mirina hucreyê ya ne-apoptotîk e ku bi kombûna vakûlên sîtoplazmayî yên berbiçav ve girêdayî ye27. Kêmasiyên morfolojîk ên ku di nematodên çamê de têne dîtin xuya dikin ku bi mekanîzmaya mirina ji ber metanê ve girêdayî ne. Muayeneya mîkroskopîk di demên cûda de nîşan da ku vakûlên mezin piştî 20 demjimêran têkiliya bi 5-îyodoîndol (0.1 mM) çêbûne. Vakûlên mîkroskopîk piştî 8 demjimêran dermankirinê hatin dîtin, û hejmara wan piştî 12 demjimêran zêde bû. Piştî 14 demjimêran çend vakûlên mezin hatin dîtin. Piştî 12-16 demjimêran dermankirinê çend vakûlên hevgirtî bi zelalî xuya bûn, ku nîşan dide ku hevgirtina vakûlan bingeha mekanîzmaya mirina metanogenîk e. Piştî 20 demjimêran, çend vakûlên mezin li seranserê kurmê hatin dîtin. Ev çavdêrî rapora yekem a metuozê di C. elegans de temsîl dikin.
Di kurmên ku bi 5-îyodîndol hatine dermankirin de, kombûn û şikestina vakuolan jî hatine dîtin (Wêne 5), wekî ku bi xwarbûna kurm û berdana vakuolan nav jîngehê ve tê îspatkirin. Têkçûna vakuolan di parzûna qalikê hêkê de jî hatiye dîtin, ku bi gelemperî di dema hêkkirinê de ji hêla L2 ve bêkêmasî tê parastin (Wêneya Pêvek S2). Ev çavdêrî piştgirî didin beşdariya kombûna şilavê û têkçûna osmoregulatory, û her weha zirara hucreyê ya berevajî (RCI), di pêvajoya çêbûna vakuolê û qelewbûnê de (Wêne 5).
Bi hîpotezkirina rola îyodê di çêbûna vakuolên çavdêrîkirî de, me çalakiya nematîsîd a sodyûm îyodîd (NaI) û potasyûm îyodîd (KI) lêkolîn kir. Lêbelê, di rêjeyên (0.1, 0.5 an 1 mM) de, wan bandor li ser nematodê û ne jî çêbûna vakuolê nekir (Wêneya Pêvek S5), her çend 1 mM KI bandorek nematîsîd a sivik hebû. Ji aliyekî din ve, 7-îyodîndol (1 an 2 mM), mîna 5-îyodîndol, gelek vakuol û deformasyonên avahîsaziyê çêkir (Wêneya Pêvek S6). Her du îyodîndol taybetmendiyên fenotipîk ên wekhev di nematodên çamê de nîşan dan, lê NaI û KI nîşan nedan. Bi balkêşî, îndol di rêjeyên ceribandinê de çêbûna vakuolê di B. xylophilus de çênekir (dane nehatine nîşandan). Bi vî rengî, encam piştrast kirin ku kompleksa îndol-îyodê berpirsiyarê vakuolîzasyon û metabolîzma B. xylophilus e.
Di nav îndolên ku ji bo çalakiya nematîsîd hatine ceribandin de, 5-îyodoîndol xwedî îndeksa herî bilind a şemitînê ya -5.89 kcal/mol bû, piştre 7-îyodoîndol (-4.48 kcal/mol), 4-fluoroîndol (-4.33), û îndol (-4.03) hatin (Wêne 6). Girêdana hîdrojenê ya stûna piştê ya xurt a 5-îyodoîndol bi leucine 218 re girêdana wê sabît dike, lê hemî derivatên din ên îndol bi rêya girêdanên hîdrojenê yên zincîra alî bi serine 260 ve girêdidin. Di nav îyodîndolên modelkirî yên din de, nirxa girêdana 2-îyodîndolê -5.248 kcal/mol e, ku ev jî ji ber girêdana wê ya sereke ya hîdrojenê bi leucine 218 re ye. Girêdanên din ên naskirî 3-îyodîndol (-4.3 kcal/mol), 4-îyodîndol (-4.0 kcal/mol), û 6-fluoroîndol (-2.6 kcal/mol) ne (Wêneya Pêvek S8). Piraniya îndolên halojenkirî û îndol bi xwe, ji bilî 5-îyodoîndol û 2-îyodoîndol, bi serîn 260 re girêdanek çêdikin. Rastiya ku girêdana hîdrojenê bi leucine 218 re nîşana girêdana receptor-lîgandê ya bi bandor e, wekî ku ji bo îvermektîn hatiye dîtin (Wêneya Pêvek S7), piştrast dike ku 5-îyodoîndol û 2-îyodoîndol, mîna îvermektîn, bi rêya leucine 218 bi qada çalak a receptora GluCL ve bi hişkî ve girêdidin (Wêne 6 û Wêneya Pêvek S8). Em pêşniyar dikin ku ev girêdan ji bo parastina avahiya porê vekirî ya kompleksa GluCL hewce ye û bi girêdana hişk bi qada çalak a receptora GluCL re, 5-îyodoîndol, 2-îyodoîndol, avermektîn û îvermektîn bi vî rengî kanala îyonê vekirî dihêlin û destûrê didin kişandina şilavê.
Girêdana molekulî ya îndol û îndolê halojenkirî bi GluCL re. Rêgezên girêdana lîgandên (A) îndol, (B) 4-fluoroîndol, (C) 7-îyodoîndol, û (D) 5-îyodoîndol bi cihê çalak ê GluCL re. Proteîn bi şerîtek tê temsîlkirin, û girêdanên hîdrojenê yên stûna bingehîn wekî xetên xalxalî yên zer têne nîşandan. (A′), (B′), (C′), û (D′) têkiliyên lîgandên têkildar bi bermayiyên asîda amînî yên derdorê re nîşan didin, û girêdanên hîdrojenê yên zincîra alî bi tîrên xalxalî yên pembe têne nîşandan.
Ji bo nirxandina bandora jehrî ya 5-îyodoîndolê li ser geşbûna tovên kelem û tirşikê ceribandin hatin kirin. 5-îyodoîndol (0.05 an 0.1 mM) an avermektîn (10 μg/mL) bandorek hindik an jî qet li ser geşbûna destpêkê û derketina nebatan nekir (Wêne 7). Wekî din, di navbera rêjeya geşbûna kontrolên nehatine dermankirin û tovên bi 5-îyodoîndol an avermektîn hatine dermankirin de ferqek girîng nehat dîtin. Bandora li ser dirêjkirina koka serpoşê û hejmara kokên alî yên çêbûyî ne girîng bû, her çend 1 mM (10 carî konsantrasyona wê ya çalak) ya 5-îyodoîndolê pêşveçûna kokên alî hinekî dereng xist. Ev encam nîşan didin ku 5-îyodoîndol ji bo şaneyên nebatan nejehrî ye û di konsantrasyonên ku hatine lêkolînkirin de mudaxeleyî pêvajoyên pêşveçûna nebatan nake.
Bandora 5-îyodoîndolê li ser şînbûna tovan. Şînbûn, şînbûn û kokkirina alî ya tovên B. oleracea û R. raphanistrum li ser navgîniya agar a Murashige û Skoog bi an bê avermectin an 5-îyodoîndol. Şînbûn piştî 3 rojan înkubasyonê li 22°C hate tomar kirin.
Ev lêkolîn çend rewşên kuştina nematodan ji hêla îndolan ve radigihîne. Ya girîng ew e ku ev yekem rapora metilasyonê ye ku îyodîndol (pêvajoyek ku ji ber kombûna vakûlên piçûk çêdibe ku hêdî hêdî dibin vakûlên mezin, di dawiyê de dibe sedema şikestina parzûnê û mirina wê) di derziyên çaman de çêdike, û îyodîndol taybetmendiyên nematîsîd ên girîng nîşan dide ku dişibin yên avermektîn a nematîsîd a bazirganî.
Berê hatiye ragihandin ku îndol di prokaryot û eukaryotan de gelek fonksiyonên sînyalê pêk tînin, di nav de astengkirin/avakirina biyofîlmê, saxmayîna bakteriyan û nexweşîbûn19,32,33,34. Di demên dawî de, bandorên dermankirinê yên potansiyel ên îndolên halojenkirî, alkaloîdên îndolê û derivatîfên îndolê yên nîv-sentetîk bala lêkolînek berfireh kişandiye35,36,37. Mînakî, hatiye nîşandan ku îndolên halojenkirî hucreyên Escherichia coli û Staphylococcus aureus ên domdar dikujin37. Wekî din, lêkolîna bandora îndolên halojenkirî li dijî cure, cins û padîşahiyên din balkêş e, û ev lêkolîn gavek ber bi gihîştina vê armancê ve ye.
Li vir, em mekanîzmayek ji bo mirina ji ber 5-îyodoîndolê di C. elegans de li ser bingeha zirara şaneyê ya berevajî (RCI) û metilasyonê pêşniyar dikin (Wêne 4C û 5). Guhertinên werimî yên wekî werimandin û dejenerasyona vakûolê nîşaneyên RCI û metilasyonê ne, ku wekî vakûolên mezin di sîtoplazmayê de têne xuyang kirin48,49. RCI bi kêmkirina hilberîna ATP-ê, dibe sedema têkçûna pompa ATPase, an jî têkbirina membranên şaneyê û dibe sedema herikîna bilez a Na+, Ca2+, û avê50,51,52, mudaxeleyî hilberîna enerjiyê dike. Vakûolên navsîtoplazmîk di şaneyên heywanan de wekî encamek kombûna şilavê di sîtoplazmayê de ji ber herikîna Ca2+ û avê53 derdikevin. Balkêş e ku ev mekanîzmaya zirara şaneyê berevajî ye ger zirar demkî be û şaneyan ji bo demek diyarkirî dest bi hilberîna ATP-ê bikin, lê heke zirar berdewam bike an xirabtir bibe, şaneyan dimirin.54 Çavdêriyên me nîşan didin ku nematodên ku bi 5-îyodoîndolê têne dermankirin piştî ku rastî şert û mercên stresê tên, nikarin biyosenteza normal vegerînin.
Fenotîpa metîlasyonê ya ku ji hêla 5-îyodoîndolê ve di B. xylophilus de çêdibe, dibe ku ji ber hebûna iyodê û belavbûna wê ya molekulî be, ji ber ku 7-îyodoîndolê bandorek kêmtir astengker li ser B. xylophilus hebû ji 5-îyodoîndolê (Tabloya 1 û Wêneya Pêvek S6). Ev encam qismî bi lêkolînên Maltese et al. (2014) re lihevhatî ne, yên ku ragihandin ku veguhastina beşa nîtrojenê ya pîrîdîl di îndolê de ji pozîsyona para- ber bi pozîsyona meta- ve vakuolîzasyon, astengkirina mezinbûnê, û sîtotoksîsîteyê di hucreyên U251 de ji holê rakir, ku ev yek nîşan dide ku têkiliya molekulê bi cîhek çalak a taybetî di proteînê de krîtîk e27,44,45. Têkiliyên di navbera îndol an îndolên halojenkirî û receptorên GluCL de ku di vê lêkolînê de hatine dîtin jî vê ramanê piştgirî dikin, ji ber ku hat dîtin ku 5- û 2-îyodoîndol ji îndolên din ên ku hatine lêkolîn kirin bihêztir bi receptorên GluCL ve girêdidin (Wêne 6 û Wêneya Pêvek S8). Hat dîtin ku îyot di pozîsyona duyemîn an pêncemîn a îndolê de bi rêya girêdanên hîdrojenê yên stûna piştê bi leucine 218 a wergirê GluCL ve girêdide, lê îndolên din ên halojenkirî û îndol bi xwe girêdanên hîdrojenê yên zincîra alî ya qels bi serîn 260 re çêdikin (Wêne 6). Ji ber vê yekê em texmîn dikin ku cihê halojenê di destpêkirina dejenerasyona vakuolê de rolek girîng dilîze, lê girêdana teng a 5-îyodoîndolê kanala îyonê vekirî dihêle, bi vî rengî rê dide herikîna bilez a şilavê û şikestina vakuolê. Lêbelê, mekanîzmaya çalakiya berfireh a 5-îyodoîndolê hîn jî nayê destnîşankirin.
Berî sepandina pratîkî ya 5-îyodoîndolê, divê bandora wê ya jehrî li ser nebatan were analîzkirin. Ceribandinên me yên li ser çandina tovan nîşan dan ku 5-îyodoîndol di rêjeyên lêkolînkirî de bandorek neyînî li ser çandina tovan an pêvajoyên pêşkeftina paşê nekiriye (Wêne 7). Bi vî awayî, ev lêkolîn bingehek ji bo karanîna 5-îyodoîndolê di jîngeha ekolojîk de peyda dike da ku zirara nematodên çamê ji bo darên çamê kontrol bike.
Raportên berê nîşan dane ku terapiya li ser bingeha îndolê rêbazek potansiyel temsîl dike ji bo çareserkirina pirsgirêka berxwedana antîbiyotîk û pêşveçûna penceşêrê55. Wekî din, îndol xwedî çalakiyên dijî-bakterî, dijî-penceşêr, antîoksîdan, dijî-iltihab, dijî-diyabetîk, dijî-vîrus, dijî-proliferatîf û dijî-tuberkulozê ne û dikarin wekî bingehek sozdar ji bo pêşkeftina dermanan xizmet bikin56,57. Ev lêkolîn ji bo cara yekem karanîna potansiyel a iyodê wekî ajanek dijî-parazît û dijî-helmintîk pêşniyar dike.
Avermektîn sê dehsal berê hate keşifkirin û di sala 2015an de Xelata Nobelê wergirt, û karanîna wê wekî anthelmintîk hîn jî bi awayekî çalak berdewam dike. Lêbelê, ji ber pêşveçûna bilez a berxwedana li hember avermektînan di nematod û kêzikên zirardar de, stratejiyek alternatîf, erzan û hawîrdorparêz hewce ye ku enfeksiyona PWN di darên çaman de kontrol bike. Ev lêkolîn her weha mekanîzmaya ku 5-iodoindole nematodên çaman dikuje û ku 5-iodoindole ji bo şaneyên nebatan jehrîbûnek kêm heye, ku ji bo serîlêdana wê ya bazirganî ya pêşerojê perspektîfên baş vedike.
Hemû ceribandin ji aliyê Komîteya Etîkê ya Zanîngeha Yeungnam, Gyeongsan, Kore ve hatin pejirandin, û rêbaz li gorî rêbernameyên Komîteya Etîkê ya Zanîngeha Yeungnam hatin kirin.
Ceribandinên înkubasyona hêkan bi karanîna prosedurên damezrandî hatin kirin43. Ji bo nirxandina rêjeyên derçûnê (HR), nematodên mezin ên 1 rojî (nêzîkî 100 mê û 100 nêr) hatin veguheztin nav tasên Petri yên ku fungus tê de bûn û hişt ku 24 demjimêran mezin bibin. Dûv re hêk hatin veqetandin û bi 5-iodoindole (0.05 mM û 0.1 mM) an avermectin (10 μg/ml) wekî rawestandinek di ava distîlkirî ya sterîl de hatin dermankirin. Ev rawestandin (500 μl; nêzîkî 100 hêk) hatin veguheztin nav qulên plakaya çanda tevnê ya 24-qulî û di 22 °C de hatin înkubasyon kirin. Jimartinên L2 piştî 24 demjimêran înkubasyonê hatin kirin lê heke hucre dema ku bi têlek platîn a nazik hatin teşwîqkirin neçûn, wekî mirî hatin hesibandin. Ev ceribandin di du qonaxan de hate kirin, her yek bi şeş dubarekirinan. Daneyên ji her du ceribandinan hatin hev kirin û pêşkêş kirin. Rêjeya HR wiha tê hesibandin:
Mirina larvayan bi karanîna prosedurên ku berê hatine pêşxistin hate nirxandin. Hêkên nematodan hatin berhevkirin û embrîyo bi rêya derxistinê di ava distîlekirî ya sterîl de hatin senkronîzekirin da ku larvayên qonaxa L2 çêbikin. Larvayên senkronîzekirî (nêzîkî 500 nematod) bi 5-îyodoîndol (0.05 mM û 0.1 mM) an avermektîn (10 μg/ml) hatin dermankirin û li ser plakayên Petri yên B. cinerea hatin mezin kirin. Piştî 48 demjimêran înkubasyonê di 22°C de, nematod di ava distîlekirî ya sterîl de hatin berhevkirin û ji bo hebûna qonaxên L2, L3, û L4 hatin lêkolînkirin. Hebûna qonaxên L3 û L4 veguherîna larvayê nîşan da, lê hebûna qonaxa L2 veguherînek nîşan neda. Wêne bi karanîna Sîstema Wênekirina Hucreya Dîjîtal a iRiS™ hatin girtin. Ev ceribandin di du qonaxan de, her yek bi şeş dubarekirinan hate kirin. Daneyên ji her du ceribandinan hatin hev kirin û pêşkêş kirin.
Jehrbûna 5-îyodoîndol û avermektîn ji bo tovan bi karanîna testên geşbûnê yên li ser plakayên agarê Murashige û Skoog hate nirxandin.62 Tovên B. oleracea û R. raphanistrum pêşî rojekê di ava distîlkirî ya sterîl de hatin şilkirin, bi 1 ml etanolê %100 hatin şuştin, bi 1 ml spîkerê bazirganî yê %50 (3% sodyûm hîpoklorît) ji bo 15 deqeyan hatin sterîlkirin, û pênc caran bi 1 ml ava sterîl hatin şuştin. Dûv re tovên sterîlkirî li ser plakayên agarê geşbûnê yên ku 0.86 g/l (0.2X) navgîniya Murashige û Skoog û 0.7% agarê bakterîolojîk bi an bê 5-îyodoîndol an avermektîn tê de hebûn, hatin pêçandin. Dûv re plak di 22 °C de hatin înkubasyonkirin, û piştî 3 rojên înkubasyonê wêne hatin kişandin. Ev ceribandin di du qonaxan de hate kirin, ku her yek ji wan şeş dubarekirin hebûn.
Dema şandinê: 26ê Sibatê 2025