Spas ji bo serdana Nature.com.Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin piştgirîya CSS-ê sînordar e.Ji bo encamên çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn guhertoyek nû ya geroka xwe bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê ya di Internet Explorer de neçalak bikin).Di vê navberê de, ji bo misogerkirina piştgirîya domdar, em malperê bêyî şêwaz an JavaScript nîşan didin.
Vedîtin û karanîna bikêrhatî ya hilberên xwezayî dikare alîkariya baştirkirina jiyana mirovan bike.Kîmyewîyên astengkirina mezinbûna nebatan bi berfirehî wekî herbicîd ji bo kontrolkirina giyayan têne bikar anîn.Ji ber hewcedariya bi karanîna cûreyên cûda yên herbicîdan, pêdivî ye ku pêkhateyên bi mekanîzmayên nû yên çalakiyê werin nas kirin.Di vê lêkolînê de, me berhevokek nû ya N-alkoxypyrrole, coumamonamide, ji Streptomyces werraensis MK493-CF1 vedît û pêvajoyek bêkêmasî ya sentezê saz kir.Bi vekolînên çalakiya biyolojîkî, me kifş kir ku urs-monoamîk asîdek navbeynkarek sentetîk a urs-monoamide û potansiyelek e.astengkerê mezinbûna nebatan.Wekî din, me cûrbecûr cûrbecûr asîda urbenonîk pêşxistiye, di nav de urbenyloxy derivative (UDA), ku xwedan çalakiya giyayî ya bilind e bêyî ku bandorek neyînî li mezinbûna hucreyên HeLa bike.Me her weha dît ku jêderkên asîdên urmotonîk mîkrotubulên nebatê dişkînin;ji bilî vê, KAND bandorê li filamentên aktin dike û mirina hucreyê çêdike;Van bandorên piralî ji yên înhîbîtorên mîkrotubulê yên naskirî cûda dibin û mekanîzmayek nû ya çalakiyê ji bo asîda ursonîk pêşniyar dikin, ku di pêşkeftina herbicîdên nû de avantajek girîng temsîl dike.
Vedîtin û sepandina pratîkî ya hilberên xwezayî yên bikêr û jêderkên wan amûrek başkirina kalîteya jiyana mirovan e.Metabolîtên duyemîn ên ku ji hêla mîkroorganîzma, nebat û kêzikan ve têne hilberandin bûne sedema pêşkeftinên mezin di derman û çandiniyê de.Gelek antîbiyotîk û dermanên dijî-leukemiyê ji hilberên xwezayî hatine çêkirin.Ji bilî vê, cureyên cuda yênpesticides, fungicides û herbicides ji van hilberên xwezayî yên ku di çandiniyê de têne bikaranîn têne derxistin.Bi taybetî, herbicîdên kontrolkirina giyayan amûrên girîng in ji bo zêdekirina hilberên çandiniyê di çandiniya nûjen de, û cûrbecûr pêkhateyên berê ji hêla bazirganî ve têne bikar anîn.Gelek pêvajoyên hucreyî yên di nebatan de, wekî fotosentez, metabolîzma asîda amînoyî, senteza dîwarê hucreyê, rêziknameya mîtozê, îşaretkirina phytohormone, an senteza proteînê, wekî armancên tîpîk ên giyayê têne hesibandin.Pêkhateyên ku fonksiyona mîkrotubulê asteng dikin çînek hevpar a giyayê ne ku bandorê li mezinbûna nebatan dikin û bandorê li rêziknameya mîtotîk dikin2.
Mîkrotubul pêkhateyên sîtoskeletonê ne û bi berfirehî di şaneyên eukaryotî de têne parastin.Heterodîmera tubulîn ji α-tubulîn û β-tubulîn pêk tê ku protofilamentên mîkrotubulê yên xêzik çêdikin, digel 13 protofilaments avahiyek cylindrîkî ava dikin.Mîkrotubul di hucreyên nebatê de gelek rol dilîzin, di nav de destnîşankirina şeklê şaneyê, dabeşbûna hucreyê, û veguheztina hundurîn3,4.Di şaneyên nebatê de mîkrotubulên di binê parzûna plazmaya navfazê de hene, û ev mîkrotubulên kortikal ên ku jê re têne gotin têne fikirîn ku organîzasyona mîkrofîbrîlên selulozê bi rêkûpêkkirina kompleksên sentaza selulozê kontrol dikin4,5.Mîkrotubulên kortik ên hucreyên epîdermal ên root, ku li devera dirêjbûna bilez a tîrêja rootê hene, li alîkî cih digirin, û mîkrofiberên selulozê van mîkrotubulan dişopînin û rêça berfirehbûna hucreyê sînordar dikin, bi vî rengî dirêjbûna şaneya anîsotropîk pêşve dike.Ji ber vê yekê, fonksiyona mîkrotubulê ji nêz ve bi morfolojiya nebatê ve girêdayî ye.Veguheztinên asîda amînî di genên ku tubulîn kod dikin de dibe sedem ku di Arabidopsis 6,7 de rêçikên mîkrotubulên kortikal çêbibin û mezinbûna milê çep an rastê.Bi vî rengî, mutasyonên di proteînên têkildar ên mîkrotubulê de ku dînamîkên mîkrotubulê birêkûpêk dikin jî dikarin rê li ber mezinbûna rokê berovajî bikin8,9,10,11,12,13.Digel vê yekê, dermankirina bi herbicîdên ku mîkrotubulan xira dikin, wek dîsopyramîd, ku wekî pretilachlor jî tê zanîn, di heman demê de dibe sedema mezinbûna rîya qelp a çepê14.Van daneyan destnîşan dikin ku rêziknameya rastîn a fonksiyona mîkrotubulê ji bo destnîşankirina rêgeza mezinbûna nebatê krîtîk e.
Cûreyên cûrbecûr astengkerên mîkrotubulê hatine keşif kirin, û van dermanan di lêkolîna sîtoskeletal de, û hem jî ji bo çandinî û derman2 de alîkariyek girîng kirine.Bi taybetî, oryzalin, pêkhateyên dinitroaniline, disopyramide, pêkhateyên girêdayî benzamide, û analogên wan dikarin fonksiyona mîkrotubulê asteng bikin û bi vî rengî mezinbûna nebatan asteng bikin.Ji ber vê yekê, ew bi berfirehî wekî herbicîd têne bikar anîn.Lêbelê, ji ber ku mîkrotubul hêmanek girîng a hucreyên nebat û heywanan in, piraniya mêtinkarên mîkrotubulê ji her du celebên hucreyê re sîtotoksîk in.Ji ber vê yekê, tevî ku karanîna wan wekî herbicîdan têne nas kirin, hejmarek sînorkirî ya antimicrotubule ji bo armancên pratîkî têne bikar anîn.
Streptomyces cinsek ji famîleya Streptomyces e, ku tê de bakteriyên aerobîk, gram-erênî, filamentous hene û bi şiyana xwe ya hilberîna cûrbecûr metabolîtên duyemîn têne zanîn.Ji ber vê yekê, ew yek ji çavkaniyên herî girîng ên hilberên xwezayî yên nû yên biyolojîkî tê hesibandin.Di lêkolîna heyî de, me pêkhateyek nû ya bi navê coumamonamide vedît, ku ji Streptomyces werraensis MK493-CF1 û S. werraensis ISP 5486 hate veqetandin. hate diyarkirin.sentez.Asîdê Ursmonîk, navberek sentetîk a ursmonoamide û jêderkên wê, hate dîtin ku mezinbûn û şînbûna nebata modela populer Arabidopsis thaliana asteng dike.Di lêkolînek pêwendiya avahî-çalakiyê de, me dît ku pêkhateyek bi C9-a ku bi asîda ursonîk ve hatî guheztin, ku jê re jêderê nonyloxy asîda ursonîk (KAND) tê gotin, bi girîngî bandora astengkirinê ya li ser mezinbûn û germbûnê zêde dike.Nemaze, astengkera mezinbûna nebatê ya ku nû hatî keşif kirin di heman demê de bandor li mezinbûna titûn û kezebê jî kir û ji bakterî an hucreyên HeLa re ne cytotoxic bû.Digel vê yekê, hin jêderkên asîdên urmotonîk fenotîpek rootê ya xerakirî çêdikin, tê vê wateyê ku van derwan rasterast an nerasterast bandorê li mîkrotubulan dikin.Li gorî vê ramanê, çavdêriyên me yên mîkrotubulên ku bi immunohistochemically an bi proteînên fluorescent hatine nîşankirin destnîşan dikin ku dermankirina KAND mîkrotubulan depolîmerîze dike.Digel vê yekê, dermankirina bi derûvên asîda kumamotonîk mîkrofilamentên aktînê têk bir.Bi vî rengî, me astengkerek mezinbûna nebatê ya nû kifş kir ku mekanîzmaya çalakiyê ya bêhempa têkbirina sîtoskeletonê vedihewîne.
Strain MK493-CF1 ji axê li Shinagawa-ku, Tokyo hate veqetandin.Strain MK493-CF1 mîcelîyûmê stromalî yê baş şax çêkir.Rêzeya qismî ya gena ARN ya rîbozomî ya 16S (1422 bp) hat diyarkirin.Ev zirav pir dişibihe S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: çenga tîpîk, %99,93).Li gorî vê encamê, hate diyarkirin ku ev çerez ji nêz ve bi cureya S. werraensis re têkildar e.Ji ber vê yekê, me bi demkî navê vê cureyê S. werraensis MK493-CF1 kir.S. werraensis ISP 5486T jî heman pêkhateyên biyoaktîf çêdike.Ji ber ku lêkolînên destpêkê yên ji bo bidestxistina hilberên xwezayî ji vê mîkroorganîzmayê hindik bûn, lêkolînên kîmyewî yên din hatin kirin.Piştî çandiniya S. werraensis MK493-CF1 li ser navgîniya ceh bi fermentasyona rewşa hişk li 30°C ji bo 14 rojan, navgîn bi %50 EtOH hate derxistin.Ji bo bidestxistina 59,5 mg ekstrakta xav 60 ml nimûne hate zuwakirin.Ekstrakta xav ji HPLC-ya qonaxa berevajî re hate şandin da ku N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, bi navê coumamonamide, 36.0 mg) bide.Tevahiya mîqdara 1-ê bi qasî 60% ji derenca xav e.Ji ber vê yekê, me biryar da ku em bi hûrgulî taybetmendiyên kumamotoamide 1 lêkolîn bikin.
Coumamonamide 1 tozek amorfek spî ye û spectrometrya girseyî ya rezîliya bilind (HRESIMS) C6H8N2O2 piştrast dike (Wêne. 1).Parçeya pîrolê ya C2-yê cîgirkirî ya vê berhevokê bi δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH di spektruma 1H NMR de: 4.5 Hz) tê destnîşan kirin. , H-5) û δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), û spektruma 13C NMR hebûna çar atomên karbonê sp2 nîşan dide.Hebûna komek amîdê li pozîsyona C2 ji hêla pêwendiya HMBC ve ji protonê C-3 ji karbonê karbonîl a amidê li δC 161.1 hate nirxandin.Wekî din, lûtkeyên 1 H û 13 C NMR li δH 4.10 (3H, S) û δC 68.3 hebûna komên N-metoksî di molekulê de destnîşan dikin.Her çend pozîsyona rast a koma metoksî hîn bi karanîna analîzên spektroskopî yên wekî spektroskopiya cûdahiya zêdekirî û kurtenivîsa navokî Overhauser (NOEDF) nehatibû destnîşankirin, N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide bû yekem pêkhateya berendam.
Ji bo destnîşankirina avahiya rast a 1, sentezek tevahî hate kirin (Hêjîrê. 2a).Dermankirina 2-aminopyridine 2 ya bazirganî ya ku bi m-CPBA re peyda dibe, di hilberîna jimareyî de N-oksîdê 3-ya têkildar bû.Piştî 2-aminoazidation of 2, reaksiyona cyclocondensation ku ji hêla Abramovich ve hatî vegotin di benzenê de di 90 ° C de hate kirin da ku 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 di gram de were bidestxistin.Leza 60% (du qonax).15,16.Methylasyon û hîdrolîza 4-ê paşê 1-metoksî-1H-pyrrole-2-karboksîlîk acid (bi navê "acîdê kumotonîk", 6) di hilberek baş de (70%, du gav) da.Di dawiyê de, amîdasyon bi navgîniya klorîda asîdê 6 bi karanîna ammonyaya avî da Kumamoto amide 1 di rêjeya 98% de.Hemî daneyên spektral ên 1-ê yên sentezkirî mîna 1-a veqetandî bûn, ji ber vê yekê avahiya 1-ê hate destnîşankirin;
Sentez û analîza gelemperî ya çalakiya biyolojîkî ya urbenamide û urbenic acid.(a) Tevahiya senteza Kumamoto amide.(b) Şitilên Erebidopsis Columbia (Col) yên heft-rojî yên çolê li ser lewheyên Murashige û Skoog (MS) yên ku coumamonamide 6 an coumamonamide 1 di nav hûrgelên destnîşankirî de vedihewîne, hatin mezin kirin.Barê pîvan = 1 cm.
Pêşîn, me çalakiyên biyolojîkî yên urbenamide û navberên wê ji bo kapasîteya wan a modulkirina mezinbûna nebatan nirxand.Me cûrbecûr ursmonamide 1 an ursmonic acid 6 li navgîna MS agar zêde kir û şitlên Arabidopsis thaliana li ser vê navgînê çandin.Van vekolînan nîşan da ku girseyên bilind (500 μM) yên 6 mezinbûna rootê asteng dike (Wêne. 2b).Dûv re, me bi cîhgirtina pozîsyona N1 ya 6-ê ve derûvên cihêreng hilberand û li ser wan lêkolînên têkiliya avahî-çalakiyê pêk anî (pêvajoya senteza analogê di Agahdariya Piştgiriyê (SI) de tê vegotin).Şitilên Arabidopsis li ser navgînek ku tê de 50 μM derûvên asîda ursonîk tê de hatin mezin kirin, û dirêjahiya kokê hate pîvandin.wek ku li ser wêneyê tê nîşandan.Wekî ku di jimarên 3a, b, û S1 de têne xuyang kirin, asîdên kumamo di pozîsyona N1 de xwedan dirêjiyên cûda yên zincîreyên alkoksî yên xêz (9, 10, 11, 12, û 13) an zincîreyên mezin ên alkoksî (15, 16, û 17) ne.Berheman astengiyek girîng a mezinbûna root nîşan dan.Wekî din, me dît ku serîlêdana 200 μM 10, 11, an 17 germbûnê asteng dike (Wêne. 3c û S2).
Lêkolîna têkiliya avahî-çalakiya Kumamoto amide û pêkhateyên têkildar.(a) Struktura û plansaziya senteza analogan.(b) Hêjdarkirina dirêjahiya rokê ya şitilên 7-rojî yên ku li ser navgîna MS-ê bi 50 μM derûvên coumamonamide an bêyî wan mezin bûne.Stêrk cudahiyên girîng bi tedawiya xapînok nîşan didin (test test, r<0.05).n>18. Daneyên wekî navîn ± SD têne nîşandan.nt tê wateya "neceribandin" ji ber ku ji% 50-ê tovan şîn nebûne.(c) Hêjdarkirina rêjeya germbûna tovên dermankirî yên ku 7 rojan di navgîna MS-ê de bi an bê 200 μM coumamonamide û pêkhateyên têkildar ve hatine inkubasyon kirin.Asterisks cudahiyên girîng bi tedawiya sham (testa chi-square) nîşan dide.n=96.
Balkêş e, lêzêdekirina zincîreyên alkîlê yên ji C9 dirêjtir çalakiya astengkirinê kêm kir, û destnîşan dike ku pêkhateyên têkildar ên kumamotoic acîd hewceyê zincîreyên alî yên pîvanek diyar in ku çalakiya xweya biyolojîkî nîşan bidin.
Ji ber ku analîza têkiliya avahî-çalakiyê destnîşan kir ku C9 ji bo asîdê ursonîk hate guheztin û jêdera neyloksî ya asîdê ursonîk (li vir wekî KAND 11 tê binav kirin) astengkirina mezinbûna nebatê ya herî bi bandor bû, me taybetmendiyek berfirehtir a KAND 11 pêk anî. Dermankirina Arabidopsis bi 50 μM KAND 11 hema hema bi tevahî rê li ber şînbûnê girt, lê hêjmarên kêmtir (40, 30, 20, an 10 μM) yên KAND 11 mezinbûna kok bi rengek girêdayî dozê asteng kir (Hêjî. 4a, b).Ji bo ceribandina ka KAND 11 bandorê li zindîbûna merîstema root dike, me merîstanên kok ên bi propidium iodide (PI) hatine xêzkirin lêkolîn kirin û mezinahiya qada merîstemê pîvandin.Mezinahiya merîstema şitilên ku li ser navgînek ku tê de 25 μM KAND-11 tê mezin kirin 151,1 ± 32,5 μm bû, dema ku mezinahiya merîstema şitilên ku li ser navgînek kontrolê ya ku DMSO tê de hatî mezin kirin 264,7 ± 30,8 μm bû (Hêl. 4c, d) , ku destnîşan dike ku KAND-11 çalakiya hucreyê vedigire.belav kirin.Root meristem.Li gorî vê yekê, dermankirina KAND 11 mîqdara nîşana dabeşbûna şaneyê CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS di merîstema kokê de kêm kir (Hêjî. 4e) 17 .Van encaman destnîşan dikin ku KAND 11 bi kêmkirina çalakiya belavbûna hucreyê ve mezinbûna root asteng dike.
Analîzkirina bandora mêtingerî ya urbenonic acid (derivatives urbenyloxy) li ser mezinbûnê.(a) Şitilên Col-ê yên çolê yên 7-rojî yên ku li ser lewheyên MS-ê bi giraniya diyarkirî ya KAND 11 mezin dibin. Pîvana pîvan = 1 cm.(b) Pîvankirina dirêjahiya root.Name cûdahiyên girîng destnîşan dikin (Tukey HSD test, r<0.05).n>16. Daneyên wekî navîn ± SD têne nîşandan.(c) Mîkroskopiya konfokal a kokên Col ên çolê yên bi îyodîd-propidium renggirtî ku li ser lewheyên MS bi an bê 25 μM KAND 11 mezin bûne.Bara pîvanê = 100 μm.(d) Hêjdarkirina mezinahiya merîstema root (n = 10 heta 11).Cûdahiyên statîstîkî bi karanîna t-testê hatine destnîşankirin (r<0.05).Bars mezinahiya navînî ya meristem temsîl dikin.(e) Mîkroskopa berevajî mudaxeleyên cihêreng (DIC) ya merîstemek koka ku avahîya CDKB2 dihewîne;1pro: CDKB2;1-GUS li ser şitlên 5-rojî yên ku li ser lewheyên MS-ê bi 25 μM KAND an jî bêyî testa KAND-ê mezin bûne hatine reng kirin û reng kirin.
Fîtotoksîkiya KAND 11 bi karanîna nebatek dîkotiledonî, tûtinê (Nicotiana tabacum), û organîzmek modela nebatê ya axê, kezebê (Marchantia polymorpha) bêtir hate ceribandin.Mîna ku di rewşa Arabidopsisê de, şitlên tûtinê SR-1 ku li ser navgîna ku 25 μM KAND 11 tê de tê mezin kirin, rehên kurttir çêdikirin (Hêl. 5a).Wekî din, 40 ji 48 tov li ser lewheyên ku tê de 200 μM KAND 11 hene şîn bûne, di heman demê de hemî 48 tov li ser medyaya ku bi xapînok hatine derman kirin şîn bûne, ev destnîşan dike ku tansiyonên bilind ên KAND girîng in (p< 0.05;chi test -square) geşbûna titûnê asteng kir.(Hêjîra 5b).Wekî din, giraniya KAND 11 a ku mezinbûna bakteriyan di kezebê de asteng dike, dişibihe giraniya bi bandor a di Arabidopsis de (Wêne. 5c).Van encaman destnîşan dikin ku KAND 11 dikare mezinbûna cûrbecûr nebatan asteng bike.Dûv re me cytotoxicity-a gengaz a pêkhateyên monoamide-ya hirçê di organîzmayên din de, ango hucreyên HeLa yên mirovî û Escherichia coli stûyê DH5α, wekî nûnerên hucreyên heywan û bakterî yên bilind, bi rêzê vekolîn.Di rêze vekolînên pirbûna hucreyê de, me dît ku coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, û KAND 11 bandor li mezinbûna şaneyên HeLa an E. coli li tansiyonên 100 μM nekiriye (Hêl. 5d, e).
Astengkirina mezinbûnê ya KAND 11 di organîzmayên ne-Arabidopsis de.(a) Şitilên tûtinê yên çolê yên SR-1 ên du hefteyî li ser lewheyên MS-ê yên ku 25 μM KAND 11 hene, hatin çandin. Pelqeyên MS yên ku 200 μM KAND hene 11. (c) Gûçikên kezebê yên cureya çolê Tak-1 ya du hefteyî ku li ser lewheyên Gamborg B5 bi giraniya KAND 11 mezin bûne. Tîrên sor sporên ku di nav inkubasyona du hefteyî de rawestiyane nîşan didin. cilhatina jinan.(d) Vekolîna pirbûna hucreyê ya hucreyên HeLa.Hejmara hucreyên zindî di navberên demkî yên diyarkirî de bi karanîna kîtek hejmartina hucreyê 8 (Dojindo) hate pîvandin.Wekî kontrolek, hucreyên HeLa bi 5 μg / ml actinomycin D (Act D) hatin derman kirin, ku veguheztina RNA polymerase asteng dike û dibe sedema mirina hucreyê.Analîz sê caran hatin kirin.(e) Vekolîna pirbûna şaneya E. coli.Mezinbûna E. coli bi pîvana OD600 ve hate analîz kirin.Wekî kontrolê, hucre bi 50 μg / ml ampicillin (Amp) hatin derman kirin, ku senteza dîwarê hucreya bakterî asteng dike.Analîz sê caran hatin kirin.
Ji bo deşîfrekirina mekanîzmaya çalakiya sîtotoksîkî ya ku ji hêla pêkhateyên têkildar ên uramide ve hatî çêkirin, me derûvên urbenic acidê yên bi bandorên astengdar ên nerm ji nû ve analîz kirin.wek ku li ser wêneyê tê nîşandan.Wekî ku di jimarên 2b, 6a de tê xuyang kirin, şitlên ku li ser lewheyên agarê yên ku tê de pîvazên bilind (200 μM) asîda urmotonîk 6 tê de hatine mezin kirin, rehên kurtir û çepgir çêdibin (θ = - 23,7 ± 6,1), lê ji şitlên ku li ser navgîna kontrolê mezin bûne, şitil hema hema rehên rast çêdibin (θ = - 3,8 ± 7,1).Tê zanîn ku ev mezinbûna oblique ya taybetmendî ji bêserûberiya mîkrotubulên kortikê pêk tê14,18.Li gorî vê vedîtinê, dermanên ku mîkrotubul-destabilîzeker disopyramide û oryzalin di bin şert û mercên mezinbûna me de guheztinek mîna hev çêdikin (Wêne. 2b, 6a).Di heman demê de, me derhênerên asîdê urmotonîk ceriband û çend ji wan hilbijart ku, di hin hûrguliyan de, mezinbûna tîrêjê ya bêkêmasî çêdibe.Pêkhateyên 8, 9, û 15 bi rêzê ve arastekirina mezinbûna root li 75 μM, 50 μM, û 40 μM guherandin, û destnîşan kir ku ev pêkhate dikarin mîkrotubulan bi bandor bêîstiqrar bikin (Hêjîra 2b, 6a).Me di heman demê de hilbera asîdeya ursolîk a herî bi hêz, KAND 11, bi giraniyek kêmtir (15 μM) ceriband û dît ku serîlêdana KAND 11 mezinbûna rootê asteng dike û ku arastekirina mezinbûna root nehevseng e, her çend ew ber bi çepê ve diçin ( Wêne C3)..Ji ber ku tansiyonên bilindtir ên dermanên mîkrotubul-destabilizker carinan li şûna ku bibe sedema zivirîna root mezinbûna nebatan asteng dike, me dûv re îhtîmala ku KAND 11 bandorê li mîkrotubulan bike bi çavdêriya mîkrotubulên kortîkal ên di hucreyên epidermal ên root de nirxand.Immunohistochemistry bi karanîna antî-β-tubulîn di şaneyên epîdermalî yên kokên şitil ên ku bi 25 μM KAND 11 hatine derman kirin, wendabûna hema hema hemî mîkrotubulên kortikal ên di şaneyên epîdermalê de li devera dirêjbûnê nîşan da (Hêjî. 6b).Van encaman destnîşan dikin ku asîda kumamotonîk û jêderkên wê rasterast an nerasterast li ser mîkrotubulan tevdigerin da ku wan bişkînin û ku ev pêkhate mêtinkarên mîkrotubulê yên nû ne.
Asîda Ursonîk û jêderkên wê mîkrotubulên kortikal ên di Arabidopsis thaliana de diguhezînin.(a) Goşeya meyldariya kokê ya ku di hebûna cûrbecûr cûrbecûr asîda urmotonîk de di hûrguliyên destnîşankirî de tê pîvandin.Bandorên du pêkhateyên ku têne zanîn ku mîkrotubulan asteng dikin: disopyramide û oryzalin jî hatin analîz kirin.Inset standarda ku ji bo pîvandina goşeya mezinbûna root tê bikar anîn nîşan dide.Stêrk cudahiyên girîng bi tedawiya xapînok nîşan didin (test test, r<0.05).n>19. Scale bar = 1 cm.(b) Mîkrotubulên kortikal ên di şaneyên epidermal ên li devera dirêjbûnê de.Mîkrotubulên di kokên Arabidopsis Col ên celebê çolê de ku li ser lewheyên MS-ê bi an bê 25 μM KAND 11 hatine mezin kirin, bi rengkirina immunohistochemical ve bi karanîna antîkorên seretayî β-tubulin û antîbodên duyemîn ên bi Alexa Fluor-conjugated ve hatine xuyang kirin.Bara pîvanê = 10 μm.(c) Avahiya mîtotîk a mîkrotubulan di merîstema kokê de.Mîkrotubul bi karanîna rengdêra immunohistochemical ve hatin xuyang kirin.Strukturên mîtotîk, di nav de deverên prophase, spindles, û phragmoplasts, ji wêneyên konfokal hatin jimartin.Tîrên strukturên mîkrotubulên mîtotîk destnîşan dikin.Stêrk cudahiyên girîng bi tedawiya xapînok nîşan didin (test test, r<0.05).n>9. Barê pîvanê = 50 μm.
Her çend Ursa xwedan şiyana têkbirina fonksiyona mîkrotubulê ye jî, mekanîzmaya çalakiya wê tê payîn ku ji ajanên depolîmerkirina mîkrotubulê yên tîpîk cûda be.Mînakî, tansiyonên zêde yên ajanên depolîmerîzasyona mîkrotubulê yên wekî dîsopyramîd û oryzalin berfirehbûna anîsotropîk a hucreyên epidermal çêdike, lê KAND 11 na.Wekî din, hev-serîlêdana KAND 11 û disopyramide encamek bertekek mezinbûna kokê ya ku ji hêla dîsopyramîdê ve hatî çêkirin û astengkirina mezinbûnê ya KAND 11-ê hate dîtin (Hêjî. S4).Me bersiva mutantê dîsopyramîdê 1-1 (phs1-1) ya zêde hesas jî ji KAND 11 re analîz kir. phs1-1 xwedan mutasyonek xala tubulîn kinase ya ne-kanonîkî ye û dema ku bi dîsopyramîdê9,20 tê derman kirin rehên kurttir çêdike.Şitilên mutant ên phs1-1 ku li ser navgîna agarê ya ku KAND 11 tê de hatî mezin kirin, xwedan rehên kurtir bûn ên mîna yên ku li ser dîsopîramîdê mezin dibin (hejmar S5).
Wekî din, me strukturên mîkrotubula mîtotîk, wek zozanên prophase, spindles, û phragmoplasts, di merîstema koka şitilên ku bi KAND 11 ve hatî derman kirin de dît. Li gorî çavdêriyên ji bo CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, kêmbûnek girîng di hejmara mîkrotubulên mîtotîk hate dîtin (Hêjî. .6c).
Ji bo taybetmendiya cytotoxicity ya KAND 11 di çareseriya subcellular de, me şaneyên suspension BY-2 tûtinê bi KAND 11 derman kir û bersiva wan temaşe kir.Me pêşî KAND 11 li şaneyên BY-2 zêde kir ku TagRFP-TUA6 diyar dikin, ku mîkrotubulan bi fluorescentî nîşan dide, da ku bandora KAND 11 li ser mîkrotubulên kortikal binirxîne.Tîrêjiya mîkrotubulê ya kortikal bi karanîna analîza wêneyê hate nirxandin, ku ji sedî pixelên sîtoskeletal di nav pîxelên sîtoplazmî de jimartin.Encamên ceribandinê destnîşan kir ku piştî dermankirina bi 50 μM an 100 μM KAND 11 ji bo 1 saetê, tîrêjê bi rêzê ve bi 0,94 ± 0,74% an jî 0,23 ± 0,28% kêm bû, dema ku dendika hucreyên ku bi DMSO re hatine dermankirin, bû 1,63 ± 0,64. % (Hêjîrê 7a).Ev encam bi çavdêriya li Arabidopsis re hevaheng in ku dermankirina KAND 11 depolîmerîzasyona mîkrotubulên kortikê çêdike (Hêjîrê. 6b).Di heman demê de me xeta BY-2 bi fîlamentên aktînê yên nîşankirî yên GFP-ABD-ê piştî dermankirina bi heman giraniya KAND 11 vekoland û dît ku dermankirina KAND 11 fîlamanên aktînê xera kir.Dermankirina bi 50 μM an 100 μM KAND 11 ji bo 1 demjimêran bi girîngî tîrêjiya fîlamentê ya aktîn kêm kir bi rêzê ve 1,20 ± 0,62% an jî 0,61 ± 0,26%, bi rêzê ve, lê dendika di şaneyên ku bi DMSO-dermankirî de 1,69 ± 0,52% bû.7b).Van encaman bi bandorên propyzamide, ku bandorê li fîlmanên aktînê nake, û latrunculin B, depolîmerkerek aktîn a ku bandorê li mîkrotubulan nake (SI Figure S6) berevajî dikin.Wekî din, dermankirina bi coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, an KAND 11 bandor li mîkrotubulên di hucreyên HeLa de nekiriye (SI Wêne S7).Ji ber vê yekê, mekanîzmaya çalakiyê ya KAND 11 tê bawer kirin ku ji ya astengkerên sîtoskeleton ên naskirî cûda ye.Wekî din, çavdêriya mîkroskopî ya me ya hucreyên BY-2 yên ku bi KAND 11 re hatine derman kirin destpêka mirina hucreyê di dema dermankirina KAND 11 de eşkere kir û destnîşan kir ku rêjeya şaneyên mirî yên şîn ên Evans piştî 30 hûrdeman dermankirina KAND 11 pir zêde zêde nebû, lê piştî 90 hûrdeman ji dermankirina bi 50 μM an 100 μM KAND, hejmara şaneyên mirî bi rêzê ve bi 43,7% an jî 80,1% zêde bû (Hêjmara 7c).Bi hev re, van daneyan destnîşan dikin ku nûjena asîda ursolîk KAND 11 înhîbîtorek sîtoskeletal-taybetî ya nebatê ye ku xwedan mekanîzmayek çalakiyê ya berê nenas e.
KAND bandorê li mîkrotubulên kortikal, filamentên aktîn û zindîbûna hucreyên BY-2 yên tûtinê dike.(a) Dîtina mîkrotubulên kortikal ên di hucreyên BY-2 de di hebûna TagRFP-TUA6 de.Hucreyên BY-2 yên ku bi KAND 11 (50 μM an 100 μM) an DMSO têne derman kirin ji hêla mîkroskopa konfokal ve hatin lêkolîn kirin.Tîrêjiya mîkrotubulê ya kortikal ji mîkrografên 25 hucreyên serbixwe hate hesibandin.Name cûdahiyên girîng destnîşan dikin (Tukey HSD test, r<0.05).Bara pîvanê = 10 μm.(b) Fîlmên aktîn ên kortîkal ên di hucreyên BY-2 de di hebûna GFP-ABD2 de têne xuyang kirin.Hucreyên BY-2 yên ku bi KAND 11 (50 μM an 100 μM) an DMSO têne derman kirin ji hêla mîkroskopa konfokal ve hatin lêkolîn kirin.Tîrêjiya fîlanên aktîn ên kortîkal ji mîkrografên 25 hucreyên serbixwe hate hesibandin.Name cûdahiyên girîng destnîşan dikin (Tukey HSD test, r<0.05).Bara pîvanê = 10 μm.(c) Çavdêriya şaneyên BY-2 yên mirî ji hêla rengkirina şîn a Evans ve.Hucreyên BY-2 yên ku bi KAND 11 (50 μM an 100 μM) an DMSO hatine derman kirin ji hêla mîkroskopiya zeviya ronî ve hatin lêkolîn kirin.n=3.Bara pîvanê = 100 μm.
Vedîtin û sepandina hilberên nû yên xwezayî di warên cûda yên jiyana mirovan de, di nav de derman û çandinî, rê li pêşkeftinên girîng girtiye.Lêkolînên dîrokî ji bo bidestxistina pêkhateyên kêrhatî ji çavkaniyên xwezayî hatine kirin.Bi taybetî, actinomycetes têne zanîn ku wekî antîbiyotîkên antîparazîtîk ji bo nematodeyan bikêr in ji ber kapasîteya wan a hilberîna metabolîteyên duyemîn ên cihêreng ên wekî avermectin, pêkhateya pêşeng a ivermectin û bleomycin û jêderkên wê, ku ji hêla dermanî ve wekî antîpenceşêrê tê bikar anîn21,22.Di heman demê de, cûrbecûr pêkhateyên giyayî ji aktînomîcetan hatine vedîtin, ku hin ji wan berê di warê bazirganî de têne bikar anîn1,23.Ji ber vê yekê, analîzkirina metabolîtên actinomycete ji bo veqetandina hilberên xwezayî bi çalakiyên biyolojîkî yên xwestî re stratejiyek bi bandor tê hesibandin.Di vê lêkolînê de, me pêkhateyek nû, coumamonamide, ji S. werraensis vedît û bi serfirazî ew sentez kir.Ursonic acid navberek sentetîk a urbenamide û jêderkên wê ye.Ew dikare bibe sedema şilbûna rokê ya taybetmendî, çalakiya giyayî ya nerm û bihêz nîşan bide, û rasterast an nerasterast zirarê bide mîkrotubulên nebatê.Lêbelê, mekanîzmaya çalakiya asîda urmotonîk dibe ku ji ya înhîbîtorên mîkrotubulê yên heyî cûda be, ji ber ku KAND 11 di heman demê de fîlamanên aktînê jî dişewitîne û dibe sedema mirina hucreyê, mekanîzmayek birêkûpêk pêşniyar dike ku bi vî rengî asîda urmotonîk û jêderkên wê bandorê li cûrbecûr avahiyên sîtoskeletal dikin..
Zêdetir taybetmendiya hûrgulî ya acida urbenonic dê bibe alîkar ku meriv mekanîzmaya çalakiya urbenonic acid çêtir fam bike.Bi taybetî, mebesta paşîn ev e ku meriv şiyana asîda ursonîk bi mîkrotubulên kêmbûyî ve girêbide da ku diyar bike ka asîda ursonîk û jêderkên wê rasterast li ser mîkrotubulan tevdigerin û wan depolîmerîze dikin, an gelo çalakiya wan dibe sedema têkçûna mîkrotubulê.Digel vê yekê, di rewşa ku mîkrotubul ne armancek rasterast in, destnîşankirina cîhê çalakiyê û armancên molekularî yên asîda ursonîk li ser hucreyên nebatê dê alîkariya bêtir famkirina taybetmendiyên pêkhateyên têkildar û awayên mimkun ên ji bo baştirkirina çalakiya herbicîdal bike.Lêkolîna biyoaktîvîteya me şiyana sîtotoksîkî ya bêhempa ya asîda ursonîk li ser mezinbûna nebatên wekî Arabidopsis thaliana, titûn û kezebê eşkere kir, dema ku ne E. coli û ne jî şaneyên HeLa bandor nebûn.Kêm an jehrîbûnek hindik ji şaneyên heywanan re avantajek jêderkên asîda ursonîk e heke ew wekî giyayê ji bo karanîna li zeviyên çandiniyê yên vekirî werin pêşve xistin.Bi rastî, ji ber ku mîkrotubul di eukaryotan de strukturên hevpar in, astengkirina wan a bijartî di nebatan de ji bo herbicîdan pêdivîyek sereke ye.Mînakî, propyzamide, melzemeyek depolymerîzasyona mîkrotubulê ku rasterast bi tubulînê ve girêdide û polîmerîzasyonê asteng dike, ji ber jehrbûna xwe ya hindik a li ser şaneyên heywanan wekî giyayî tê bikar anîn24.Berevajî dîsopyramîdê, benzamîdên têkildar xwedî taybetmendiyên armancê yên cihê ne.Ji bilî mîkrotubulên nebatê, RH-4032 an benzoxamide jî mîkrotubulên şaneyên heywanan an jî oomycetes, bi rêzê ve asteng dike, û zalilamide ji ber fîtotoksîkiya xwe ya kêm wekî fungîsîd tê bikar anîn25,26,27.Hirçê ku nû hatiye keşifkirin û jêderkên wê li dijî nebatan cytotoxicityek bijartî nîşan didin, lê hêjayî gotinê ye ku guheztinên din dikarin taybetmendiya wan biguhezînin, potansiyel ji bo kontrolkirina fungî an oomycetes pathogenîk deranên din peyda bikin.
Taybetmendiyên bêhempa yên urbenonic acid û jêderkên wê ji bo pêşkeftina wan wekî herbicîd û karanîna wekî amûrên lêkolînê bikêr in.Girîngiya sîtoskeletonê di kontrolkirina şeklê şaneya nebatê de bi berfirehî tê nas kirin.Lêkolînên berê destnîşan kirin ku nebat bi kontrolkirina dînamîkên mîkrotubulê ve mekanîzmayên tevlihev ên rêxistina mîkrotubula kortikal pêşve xistine da ku bi rêkûpêk morphogenesis kontrol bikin.Hejmarek mezin ji molekulên ku ji rêziknameya çalakiya mîkrotubulê berpirsiyar in hatine nas kirin, û lêkolîna têkildar hîn jî berdewam e3,4,28.Têgihiştina meya heyî ya dînamîkên mîkrotubulê di hucreyên nebatê de bi tevahî mekanîzmayên rêxistina mîkrotubula kortikal rave nake.Mînakî, her çend hem disopyramîd û hem jî oryzalin dikarin mîkrotubulan depolymerîze bikin jî, disopyramide dibe sedema guheztina giran a rootê dema ku oryzalin xwedan bandorek nermî ye.Digel vê yekê, mutasyonên di tubulînê de, ku mîkrotubulan stabîl dike, di heman demê de dibe sedema dextrorotation di rûkan de, lê paclitaxel, ku di heman demê de dînamîkên mîkrotubulan jî aram dike, na.Ji ber vê yekê, lêkolîn û naskirina armancên molekularî yên ursolic acid divê di rêziknameya mîkrotubulên kortikê yên nebatê de nihêrînên nû peyda bike.Di heman demê de, danberhevên pêşerojê yên kîmyewî yên ku di pêşvebirina mezinbûna guhezbar de bi bandor in, wek dîsopyramide, û kîmyewî yên kêmtir bi bandor, wek oryzalin an kumamotoric acid, dê nîşanan peyda bikin ka çawa mezinbûna çolê çêdibe.
Ji hêla din ve, vesazkirinên sîtoskeletal ên girêdayî berevaniyê îmkanek din e ku ravekirina cytotoxicity asîda ursonîk.Infeksiyona pathogenek an danasîna hilberek di nav şaneyên nebatê de carinan dibe sedema hilweşîna sîtoskeleton û paşê mirina şaneyê29.Mînakî, cryptoxanthin-a ku ji oomycete hatî peyda kirin hate ragihandin ku berî mirina hucreya tûtinê mîkrotubul û fîlmanên aktînê têk dide, mîna ya ku bi dermankirina KAND-ê re çêdibe30,31.Wekheviyên di navbera bersivên parastinê û bersivên hucreyî yên ku ji hêla ursonic acid ve têne çêkirin me rê da ku em hîpotez bikin ku ew pêvajoyên hucreyî yên hevpar dişoxilînin, her çend bandorek zûtir û bihêztir a acida ursonîk ji cryptoxanthin diyar e.Lêbelê, lêkolînan destnîşan kir ku têkçûna fîlamanên aktîn mirina hucreyê ya spontan pêşve dike, ku her gav bi têkçûna mîkrotubulê re ne29.Digel vê yekê, ew dimîne ku were dîtin ka an pathogen an jî çêker dibe sedema mezinbûna guhê zirav, wekî ku derûvên asîda ursonîk dikin.Ji ber vê yekê, zanîna molekulî ku bersivên parastinê û cytoskeleton ve girêdide pirsgirêkek balkêş e ku were çareser kirin.Bi karanîna hebûna pêkhateyên giraniya molekularî yên kêm ên bi asîda ursonîk ve, û hem jî cûrbecûr jêderên bi potansiyelên cihêreng, ew dikarin derfetan peyda bikin ku mekanîzmayên hucreyî yên nenas hedef bikin.
Bi hev re, vedîtin û sepandina pêkhateyên nû yên ku dînamîkên mîkrotubulan modul dikin dê rêbazên hêzdar peyda bikin da ku mekanîzmayên molekulî yên tevlihev ên ku di binê destnîşankirina şeklê şaneya nebatê de ne çareser bikin.Di vê çarçoveyê de, pêkhateya urmotonîk a vê dawiyê pêşkeftî, ku bandorê li mîkrotubulan û filamanên aktînê dike û mirina hucreyê çêdike, dibe ku fersendek peyda bike ku pêwendiya di navbera kontrola mîkrotubulê û van mekanîzmayên din de deşîfre bike.Bi vî rengî, analîzên kîmyewî û biyolojîkî bi karanîna urbenonic acid dê ji me re bibe alîkar ku mekanîzmayên birêkûpêk ên molekulî yên ku sîtoskeletonê nebatê kontrol dikin fam bikin.
S. werraensis MK493-CF1 têxin firaxeke Erlenmeyer a 500 mL ya ku tê de 110 mL navgîna tovê ku ji %2 (w/v) galaktoz, 2% (w/v) pasta esence, 1% (w/v) pêkhateya bactoyê pêk tê, tê vedan. .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) jêgirtina ceh (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonya), 0,2% (w/v) (NH4) 2SO4 û 0,2% CaCO3 di ava deyonîzekirî de.(pH 7.4 berî sterilîzekirinê).Çandinên tovê 2 rojan li ser şekerek zivirî (180 rpm) di germahiya 27°C de hatin înkubakirin.Çandiniya hilberînê bi fermentasyona dewleta hişk.Çanda tovê (7 ml) hate veguheztin nav flaskek K-1 ya 500 ml ku tê de 40 g navgîna hilberînê ya ku ji 15 g ceyrê çapkirî (MUSO Co., Ltd., Japonya) û 25 g ava deionîzekirî (pH nayê sererast kirin) pêk tê. berî sterilîzekirinê).).Fermentasyon 14 rojan li 30 ° C di tariyê de hate kirin.Madeya fermentasyonê bi 40 ml/şûşeyek EtOH hat derxistin û santrîfuj kirin (1500 g, 4°C, 10 min).Spernatantê çandê (60 ml) bi tevlîheviya 10% MeOH/EtOAc hat derxistin.Tebeqeya organîk di bin zexta kêmbûyî de hat rijandin da ku bermayîyek (59,5 mg) bi dest bixe, ku bi HPLC-ê bi elusyona gradient (0-10 hûrdem: 90%) li ser stûnek qonaxa berevajî (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × dirêjî 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 hûrdem: 90% H2O/CH3CN heta 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 hûrdem: 90% H2O/EtOH, 45–155 hûrdem: 90% H2O /EtOH heta 100% EtOH (gradient (gradient), 155-200 min: 100% EtOH) bi rêjeya herikîna 1.5 ml/min, coumamonamide (1, 36.0 mg) wekî tozek amorf a spî hate veqetandin.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ nirxa hesabkirî: 141,0659, nirxa pîvandinê: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 153 cm
Tovên Kolombiyayê (Col-0) ji Navenda Çavkaniyên Biyolojîk a Arabidopsis (ABRC) bi destûra karanîna lêkolînê hatine wergirtin.Tovên Col-0 di bin şert û mercên laboratûara me de hatin belav kirin û parastin û wekî nebatên çolê Arabidopsis hatin bikar anîn.Tovên Arabidopsis li ser rûyê erdê sterilîze kirin û di navgîniya Murashige û Skoog nîv-hêz de ku tê de 2% sukroz (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morfolîno) asîda etansulfonîk (MES) (Fujifilm Wako Pure) tê de hatin çandin. ).) û 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, li 23 °C û ronahiya domdar.Tovên mutantê phs1-1 ji hêla T. Hashimoto (Enstîtuya Zanist û Teknolojiyê ya Nara) ve hatin peyda kirin.
Tovên cureya SR-1 ji hêla T. Hashimoto (Enstîtuya Zanist û Teknolojiyê ya Nara) ve hatine peyda kirin û wekî nebatên tûtinê yên çolê hatine bikar anîn.Tovên tûtinê li ser rûyê erdê hatin sterilîzekirin û sê şevan di nav ava sterîl de hatin rijandin da ku geşbûn çêbibe, dûv re di nav çareseriyek nîv-hêz a ku 2% sukroz, 0,05% (w/v) MES, û 0,8% gum gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) tê de hatin danîn. Murashige.û Skoog navîn) bi pH 5.7 û li 23°C di bin ronahiya domdar de tê înkubakirin.
Strain Tak-1 ji hêla T. Kohchi (Zanîngeha Kyoto) ve hate peyda kirin û wekî yekîneya ceribandinê ya standard ji bo lêkolîna kezebê hate bikar anîn.Gemma ji nebatên çandî yên sterilîzekirî hate wergirtin û dûv re li ser navgîniya Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) ku ji %1 sucrose û %0.3 gum gellan tê de, hate çandin û li 23°C di bin ronahiya domdar de hate înkubakirin.
Hucreyên BY-2 yên tûtinê (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ji hêla S. Hasezawa (Zanîngeha Tokyo) ve hatî peyda kirin.Hucreyên BY-2 di navgîniya Linsmeier û Skoog a guhertî de 95 qat hatin rijandin û her hefte bi 2,4-dîchlorophenoxyacetic acid 32 ve hatin zêdekirin.Rawestandina hucreyê di tariyê de di germahiya 27°C de bi leza 130 rpm li ser şekerek zivirî hate tevlihev kirin.Hucreyên bi 10 qatê navgîna nû ve bişon û di heman navgînê de ji nû ve bişon.Xetên hucreya transgenîk BY-2 ku bi domdarî nîşana mîkrotubulê TagRFP-TUA6 an nîşana pelamenta aktîn GFP-ABD2 di binê pêşekvana virusa mozaîka kulîlkê 35S de bi îstîqrar îfade dikin, wekî ku hatî destnîşan kirin33,34,35.Van xetên hucreyê dikarin bi karanîna prosedurên mîna yên ku ji bo xeta hucreya orjînal BY-2 têne bikar anîn werin parastin û hevdem kirin.
Hucreyên HeLa di navgîniya Eagle ya guhertî ya Dulbecco (DMEM) (Teknolojiyên Jiyanê) de ku bi 10% seruma fetusê ya fetus, 1.2 U/ml penîsîlîn, û 1.2 μg/ml streptomycin di înkubatorek 37°C de bi 5% CO2 ve hatî pêve kirin, hatin çandin.
Hemî ceribandinên ku di vê destnivîsê de hatine vegotin li gorî rêzikname û rêwerzên biyoewlehiya Japonî hatine kirin.
Tevlîhev di dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) de wekî çareseriyên stokê hatin hilweşandin û di navgîna MS-ê de ji bo Arabidopsis û tûtinê an navgîna Gamborg B5 ji bo kezebê hatin rijandin.Ji bo ceribandina astengkirina mezinbûna root, zêdetirî 10 tov di her plakê de li ser navgîniya agar a ku pêkhateyên destnîşankirî an DMSO vedihewîne hatin çandin.Tov di jûreyek mezinbûnê de 7 rojan hatin inkubasyon kirin.Şitil hatin kişandin û dirêjiya kok hatin pîvandin.Ji bo ceribandina germbûna Arabidopsis, 48 tov ji her plakê li ser navgînek agar a ku tê de 200 μM pêkhatî an DMSO tê de hatin çandin.Tovên arabidopsis di odeyek mezinbûnê de hatin çandin û 7 roj piştî şînbûnê (dag) hejmara şitilên şînbûyî hatin jimartin.Ji bo pîvandina germbûna tûtinê, ji her plakê 24 tov li ser agarê ku 200 μM KAND an DMSO tê de hatine çandin.Tovên titûnê di odeyeke mezinbûnê de hatin çandin û piştî 14 rojan hejmara şitlên şînbûyî hatin jimartin.Ji bo pîvandina astengkirina mezinbûna kezebê, 9 embrîyo ji her plakekê li ser navgînek agarê ya ku tê de hêjmarên destnîşankirî yên KAND an DMSO tê de hatin danîn û 14 rojan di jûreyek mezinbûnê de hatin inkubasyon kirin.
Nebatên ku bi 5 mg/ml propidium iodide (PI) hatine boyaxkirin bikar bînin da ku rêxistina merîstemê ya root xuya bikin.Nîşaneyên PI-ê bi mîkroskopa floransê ve bi karanîna mîkroskopa şopandina lazerê ya konfokal a TCS SPE (Leica Microsystems) ve hatin dîtin.
Li gorî protokola ku ji hêla Malami û Benfey36 ve hatî destnîşan kirin, xêzkirina histokîmyayî ya rehên bi β-glukuronidase (GUS) hate kirin.Şev bi şev di nav 90% acetone de hatin qewirandin, bi 0,5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic asîd di tampon GUS de 1 demjimêran hatin rijandin û di nav çareseriyek kloraldehîdê hîdrokirî de hatin danîn.(8 g hîdratê kloral, 2 ml av û 1 ml glycerol) û bi mîkroskopa berevajî ya navbeynkariya cihêreng bi karanîna mîkroskopa Axio Imager M1 (Carl Zeiss) ve hatî dîtin.
Li ser şitlên 7-rojî yên ku li ser lewheyên vertîkal hatine çandin hatine pîvandin.Wekî ku di gava 6-an de hatî destnîşan kirin goşeya kokê ji hêla vektora gravîtasyonê ve bipîvin.
Rêzkirina mîkrotubulên kortikal wekî ku hatî destnîşan kirin, bi guhertinên piçûk ên protokolê 37 hate dîtin.Antî-β-tubulîn (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) û Alexa Fluor 488-conjugated IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) di 1:1000 û 1:100 de wekî antîbodên seretayî û navîn hatin bikar anîn. herwiha.Wêneyên floransê bi karanîna mîkroskopa şopandina lazerê ya konfokal a TCS SPE (Leica Microsystems) hatin wergirtin.Wêneyên Z-stack bidest bixin û li gorî rêwerzên çêker pêşnûmeyên tundiya herî zêde biafirînin.
Li gorî rêwerzên çêker bi karanîna Kit Hejmarkirina Hucreyê 8 (Dojindo) vekolîna pirbûna hucreya HeLa hate kirin.
Mezinbûna E. coli DH5α bi pîvandina dendika hucreyê ya di çandê de bi karanîna spektrofotometerek li 600 nm (OD600) hate analîz kirin.
Rêxistina sîtoskeletal di şaneyên BY-2 yên transgenîk de bi karanîna mîkroskopa fluorescence ya ku bi cîhaza şopandina konfokal a CSU-X1 (Yokogawa) û kamerayek sCMOS (Zyla, Andor Technology) ve hatî vedîtin hate dîtin.Tîrêjiya sîtoskeletal ji hêla analîzkirina wêneyê ve hate nirxandin, ku ji sedî pîxelên sîtoskeletê di nav pîxelên sîtoplazmî de di wêneyên konfokal de bi karanîna nermalava ImageJ-ê wekî ku hatî diyar kirin38,39 jimartin.
Ji bo tesbîtkirina mirina hucreyê di şaneyên BY-2 de, perçeyek suspensiona hucreyê bi 0,05% Evans blue 10 deqîqeyan li germahiya odeyê hate înkubakirin.Rengkirina şîn a Evans a Hilbijartî ya hucreyên mirî bi derxistina rengê ji şaneyên zindî ve ji hêla parzûna plazmayê ya saxlem ve girêdayî ye40.Hucreyên rengkirî bi karanîna mîkroskopa zeviyek geş (BX53, Olympus) hatin dîtin.
Hucreyên HeLa li DMEM-ê ku bi 10% FBS ve hatî zêdekirin di inkubatorek şilkirî de li 37°C û 5% CO2 hatin mezin kirin.Hucre bi 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng / ml colcemid (Gibco), an 100 ng / ml Nocodmaze (Sigma) ji bo 6 saetan li 37 ° C hatin derman kirin.Di germahiya odeyê de şaneyên 10 hûrdemî bi MetOH û dûv re jî 5 hûrdeman bi acetate re hatin sabît kirin.Hucreyên sabît bi antîbodya bingehîn a β-tubulîn (1D4A4, Proteintech: 66240-1) 2 saetan di 0.5% BSA/PBS de hate şûştin, 3 caran bi TBST ve hatin şûştin, û dûv re bi antîbodyê bizinê Alexa Fluor ve hatin inkubasyon.488 1 saet.- Mişk IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) û 15 ng/ml 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) di 0,5% BSA/PBS de tê rijandin.Piştî sê caran şuştina bi TBST, hucreyên rengkirî li ser mîkroskopa berevajîkirî ya Nikon Eclipse Ti-E hatin dîtin.Wêneyên bi kamerayek Hamamatsu ORCA-R2 CCD ya sarkirî bi karanîna nermalava MetaMorph (Alavên Molekuler) hatin kişandin.
Dema şandinê: Jun-17-2024