Spas ji bo serdana Nature.com. Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin piştgiriya CSS-ê bi sînor e. Ji bo encamên çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn guhertoyek nûtir a geroka xwe bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê di Internet Explorer-ê de neçalak bikin). Di vê navberê de, ji bo misogerkirina piştgiriya domdar, em malperê bêyî şêwazkirin an JavaScript nîşan didin.
Vedîtin û bikaranîna sûdmend a berhemên xwezayî dikare bibe alîkar ji bo baştirkirina jiyana mirovan. Kîmyewiyên astengker ên mezinbûna nebatan bi berfirehî wekî herbisîdan ji bo kontrolkirina giyayên zirardar têne bikar anîn. Ji ber ku pêdivî bi karanîna celebên cûda yên herbisîdan heye, pêdivî bi destnîşankirina pêkhateyên bi mekanîzmayên çalakiyê yên nû heye. Di vê lêkolînê de, me pêkhateyek nû ya N-alkoxypyrrole, kuumamonamîd, ji Streptomyces werraensis MK493-CF1 keşf kir û pêvajoya sentezê ya tevahî saz kir. Bi rêya ceribandinên çalakiya biyolojîkî, me keşf kir ku asîda urs-monoamîk navbeynkarek sentetîk a urs-monoamidê ye û potansiyelek e.astengkerê mezinbûna nebatanWekî din, me gelek derivatên asîda urbenonîk pêşxistine, di nav de derivata urbenîloksî (UDA), ku xwedî çalakiya gihayî ya bilind e bêyî ku bandorek neyînî li ser mezinbûna hucreyên HeLa bike. Me her weha dît ku derivatên asîda urmotonîk mîkrotubulên nebatan têk dibin; ji bilî vê, KAND bandorê li fîlamentên aktînê dike û dibe sedema mirina hucreyê; Ev bandorên piralî ji yên astengkerên mîkrotubulên naskirî cuda ne û mekanîzmayek çalakiyê ya nû ji bo asîda ursonîk pêşniyar dikin, ku avantajek girîng di pêşkeftina gihayîsîdên nû de temsîl dike.
Vedîtin û sepandina pratîkî ya berhemên xwezayî yên sûdmend û berhemên wan rêbazek e ji bo baştirkirina kalîteya jiyana mirovan. Metabolîtên duyemîn ên ku ji hêla mîkroorganîzmayan, nebatan û kêzikan ve têne hilberandin, bûne sedema pêşketinên mezin di derman û çandiniyê de. Gelek antîbiyotîk û dermanên dijî-losemiyê ji berhemên xwezayî hatine pêşve xistin. Wekî din, cûrbecûr celebêndermanên kêzikan, fungîsîd û herbîsîd ji van berhemên xwezayî ji bo karanîna di çandiniyê de têne derxistin. Bi taybetî, herbîsîdên kontrolkirina gihayan amûrên girîng in ji bo zêdekirina berhemên çandiniyê di çandiniya nûjen de, û cûrbecûr celebên pêkhateyan jixwe bi bazirganî têne bikar anîn. Çend pêvajoyên hucreyî di nebatan de, wekî fotosentez, metabolîzma asîdên amînî, senteza dîwarê hucreyê, rêkxistina mîtozê, sînyala fîtohormonê, an senteza proteînê, wekî hedefên tîpîk ên herbîsîdan têne hesibandin. Pêkhateyên ku fonksiyona mîkrotubulê asteng dikin çînek hevpar a herbîsîdan in ku bi bandorkirina rêkxistina mîtozê bandorê li mezinbûna nebatan dikin2.
Mîkrotubul pêkhateyên sîtoskeletê ne û di hucreyên eukaryotîk de bi berfirehî têne parastin. Heterodîmera tubulînê ji α-tubulîn û β-tubulîn pêk tê ku protofîlamentên mîkrotubulên xêzikî çêdikin, bi 13 protofîlamentan ku avahiyek silindirî çêdikin. Mîkrotubul di hucreyên nebatan de gelek rolan dilîzin, di nav de destnîşankirina şeklê hucreyê, dabeşbûna hucreyê, û veguhastina nav hucreyê3,4. Hucreyên nebatan di bin parzûna plazmaya navbera qonaxan de mîkrotubulan dihewînin, û tê texmîn kirin ku ev mîkrotubulên kortîkal ên ku jê re dibêjin mîkrofîbrîlên selulozê bi rêya rêkxistina kompleksên sentaza selulozê kontrol dikin4,5. Mîkrotubulên kortîkal ên hucreyên epidermal ên kokê, ku di herêma dirêjkirina bilez a serê kokê de hene, li kêlekê ne, û mîkrofîberên selulozê li pey van mîkrotubulan diçin û rêça berfirehbûna hucreyê sînordar dikin, bi vî rengî dirêjkirina hucreya anîzotropîk pêşve dixin. Ji ber vê yekê, fonksiyona mîkrotubulê bi morfolojiya nebatan ve girêdayî ye. Guhertinên asîdên amînî di genên ku tubulin kod dikin de dibin sedema çewtiya rêzikên mîkrotubulên kortîkal û mezinbûna çep-an-rast di Arabidopsis 6,7 de. Bi heman awayî, mutasyonên di proteînên girêdayî mîkrotubulê de ku dînamîkên mîkrotubulê rêk dixin jî dikarin bibin sedema mezinbûna kokê ya xirab 8,9,10,11,12,13. Wekî din, dermankirina bi herbisîtên ku mîkrotubulê têk dibin wekî disopyramide, ku wekî pretilachlor jî tê zanîn, dibe sedema mezinbûna koka oblîk a çep-alî 14. Ev dane nîşan didin ku rêkxistina rast a fonksiyona mîkrotubulê ji bo destnîşankirina rêça mezinbûna nebatan girîng e.
Cureyên cûrbecûr ên astengkerên mîkrotubulan hatine keşifkirin, û van dermanan beşdarîyên girîng di lêkolîna sîtoskeletê, û her weha di çandinî û bijîşkîyê de kirine2. Bi taybetî, oryzalin, pêkhateyên dinitroaniline, disopyramide, pêkhateyên bi benzamide ve girêdayî, û analogên wan dikarin fonksiyona mîkrotubulan asteng bikin û bi vî rengî mezinbûna nebatan asteng bikin. Ji ber vê yekê, ew bi berfirehî wekî herbisîd têne bikar anîn. Lêbelê, ji ber ku mîkrotubul pêkhateyek girîng a şaneyên nebat û heywanan in, piraniya astengkerên mîkrotubulan ji bo her du celebên şaneyan sîtotoksîk in. Ji ber vê yekê, tevî karanîna wan a wekî herbisîdên naskirî, hejmareke sînorkirî ya ajanên antîmîkrotubulan ji bo armancên pratîkî têne bikar anîn.
Streptomyces cinsek ji malbata Streptomyces e, ku bakteriyên aerobîk, gram-pozîtîf, filamentoz dihewîne û bi şiyana xwe ya hilberîna rêzek fireh ji metabolîtên duyemîn tê zanîn. Ji ber vê yekê, ew wekî yek ji çavkaniyên herî girîng ên hilberên xwezayî yên biyolojîkî yên çalak tê hesibandin. Di vê lêkolînê de, me pêkhateyek nû bi navê kumamonamîd keşf kir, ku ji Streptomyces werraensis MK493-CF1 û S. werraensis ISP 5486 hate veqetandin. Bi karanîna analîza spektral û analîza spektral a tevahî, avahiya kumamonamîd hate taybetmendî kirin û îskeleta wê ya bêhempa ya N-alkoxypyrrole hate destnîşankirin. sentez. Asîda ursmonîk, navbeynkarek sentetîk a ursmonoamide û derivatên wê, hat dîtin ku mezinbûn û geşbûna nebata modela populer Arabidopsis thaliana asteng dike. Di lêkolînek têkiliya avahî-çalakiyê de, me dît ku pêkhateyek bi C9-ê ku ji bo asîda ursonic hatiye guherîn, ku jê re derivatîfa nonyloxy ya asîda ursonic (KAND) tê gotin, bandora astengker li ser mezinbûn û geşbûnê bi girîngî zêde dike. Bi taybetî, astengkerê mezinbûna nebatan ê nû hatiye keşifkirin bandor li mezinbûna titûn û kezeba sor jî kiriye û ji bo bakteriyan an şaneyên HeLa sîtotoksîk nebûye. Wekî din, hin derivatên asîda urmotonîk fenotipek kokê ya xirabkirî çêdikin, ku ev yek nîşan dide ku ev derivat rasterast an nerasterast bandorê li mîkrotubulan dikin. Li gorî vê ramanê, çavdêriyên me yên li ser mîkrotubulên ku bi awayekî îmmunohîstokîmyayî an jî bi proteînên fluoresan hatine nîşankirin nîşan didin ku dermankirina KAND mîkrotubulan depolimerîze dike. Wekî din, dermankirina bi derivatên asîda kumamotonîk mîkrofîlamentên aktînê têk bir. Bi vî rengî, me astengkerek mezinbûna nebatan a nû keşif kiriye ku mekanîzmaya wê ya bêhempa ya çalakiyê hilweşandina sîtoskeletê vedihewîne.
Cureyê MK493-CF1 li Shinagawa-ku, Tokyo, ji axê hat veqetandin. Cureyê MK493-CF1 mîselyûma stromal a şaxdar çêkir. Rêzeya qismî ya gena RNA ya rîbozomal a 16S (1422 bp) hat destnîşankirin. Ev cure pir dişibihe S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: cureya tîpîk, 99.93%). Li gorî vê encamê, hat destnîşankirin ku ev cure bi cureya cureya S. werraensis ve girêdayî ye. Ji ber vê yekê, me navê demkî li vê cureyê kir S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T jî heman pêkhateyên biyoaktîf hildiberîne. Ji ber ku lêkolînên destpêkê yên li ser bidestxistina berhemên xwezayî ji vê mîkroorganîzmê kêm bûn, lêkolînên kîmyewî yên din hatin kirin. Piştî çandina S. werraensis MK493-CF1 li ser navgîna ceh bi fermentasyona rewşa hişk di 30°C de ji bo 14 rojan, navgîn bi 50% EtOH hate derxistin. 60 ml nimûne hate hişk kirin da ku 59.5 mg ekstrakta xav were bidestxistin. Ekstrakta xav ji bo HPLC-ya qonaxa berevajî hate derbas kirin da ku N-metoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, bi navê kumamonamîd, 36.0 mg) bide. Tevahiya mîqdara 1 bi qasî 60% ji ekstrakta xav e. Ji ber vê yekê, me biryar da ku taybetmendiyên kumamotoamide 1 bi berfirehî lêkolîn bikin.
Kumamonamîd 1 tozeke amorf a spî ye û spektrometriya girseyî ya çareseriya bilind (HRESIMS) C6H8N2O2 piştrast dike (Wêne 1). Parçeya pîrolê ya bi C2-guherandî ya vê pêkhateyê bi δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH di spektruma 1H NMR de: 4.5 Hz, H-5) û δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) tê taybetmend kirin, û spektruma 13C NMR hebûna çar atomên karbonê yên sp2 nîşan dide. Hebûna komeke amîd li pozîsyona C2 bi korelasyona HMBC ji protona C-3 ber bi karbona amîd karbonîl li δC 161.1 hate nirxandin. Herwiha, lûtkeyên 1H û 13C NMR li δH 4.10 (3H, S) û δC 68.3 hebûna komên N-metoxî di molekulê de nîşan didin. Her çend pozîsyona rast a koma metoksî hîn bi karanîna analîza spektroskopîk wekî spektroskopiya cudahiya pêşkeftî û kurtenivîsa Overhauser a navokî (NOEDF) nehatibû destnîşankirin jî, N-metoxî-1H-pîrrol-2-karboksamîd bû pêkhateya yekem a namzed.
Ji bo diyarkirina avahiya rast a 1, sentezek tevahî hate kirin (Wêne 2a). Dermankirina 2-amînopîrîdîn 2 ya bazirganî bi m-CPBA re bû sedema N-oksîda 3 ya têkildar bi rêjeya hejmarî. Piştî 2-amînoazîdasyona 2, reaksiyona sîklokondensasyonê ya ku ji hêla Abramovich ve hatî vegotin di benzenê de di 90°C de hate kirin da ku 1-hîdroksî-1H-pîrol-2-karbonîtrîl 5 ya xwestî bi gram were bidestxistin. Leza 60% (du qonax). 15,16. Metîlasyon û hîdrolîza 4 dûv re asîda 1-metoksî-1H-pîrol-2-karboksîlîk (ku wekî "asîda kumotonîk" tê binavkirin, 6) bi rêjeya baş (70%, du gav) da. Di dawiyê de, amîdasyon bi rêya navbeynkariya asîd klorîd 6 bi karanîna amonyaka avî amîdê Kumamoto 1 bi rêjeya 98% da. Hemî daneyên spektral ên 1-ya sentezkirî dişibin 1-ya îzolekirî, ji ber vê yekê avahiya 1 hate destnîşankirin;
Senteza giştî û analîza çalakiya biyolojîk a urbenamîd û asîda urbenîk. (a) Senteza tevahî ya amîda Kumamoto. (b) Şitilên heft rojî yên Arabidopsis Columbia (Col) yên cureya kovî li ser plakayên Murashige û Skoog (MS) hatin çandin ku di konsantrasyonên destnîşankirî de kumamonamîd 6 an jî kumamonamîd 1 tê de hene. Şêweya pîvanê = 1 cm.
Pêşî, me çalakiyên biyolojîkî yên urbenamide û navberên wê ji bo şiyana wan a modûlkirina mezinbûna nebatan nirxand. Me cûrbecûr ursmonamide 1 an asîda ursmonîk 6 li navgîna agar a MS zêde kir û şitlên Arabidopsis thaliana li ser vê navgînê çandin. Van ceribandinan nîşan dan ku rêjeyên bilind (500 μM) yên 6 mezinbûna reh asteng dikin (Wêne 2b). Piştre, me bi danîna pozîsyona N1 ya 6 gelek derivatîv çêkirin û lêkolînên têkiliya avahî-çalakiyê li ser wan pêk anîn (pêvajoya senteza analog di Agahiyên Piştgiriyê (SI) de tê vegotin). Şitlên Arabidopsis li ser navgînek ku 50 μM derivatîvên asîda ursonic tê de hene hatin çandin, û dirêjahiya reh hate pîvandin, wekî ku di wêneyê de tê xuyang kirin. Wekî ku di Wêneyên 3a, b û S1 de tê xuyang kirin, asîdên kumamo xwedî dirêjahiyên cûda yên zincîrên alkoksî yên xêzikî (9, 10, 11, 12, û 13) an zincîrên alkoksî yên mezin (15, 16, û 17) li pozîsyona N1 in. Derîvatan astengkirineke girîng a mezinbûna reh nîşan dan. Wekî din, me dît ku sepandina 200 μM 10, 11, an 17 şînbûnê asteng kir (Wêne 3c û S2).
Lêkolîna têkiliya avahî-çalakiya amîda Kumamoto û pêkhateyên têkildar. (a) Şêweya avahî û senteza analogan. (b) Pîvandina dirêjahiya rehê nebatên 7 rojî yên ku li ser navgîna MS bi an bêyî derivatîfên kumamonamîd ên 50 μM mezin bûne. Stêrk cûdahiyên girîng bi dermankirina sexte nîşan didin (test t, p< 0.05). n>18. Daneyên wekî navînî ± SD têne nîşandan. nt tê wateya "nehatiye ceribandin" ji ber ku ji %50 zêdetir tov şîn nebûn. (c) Pîvandina rêjeya şînbûnê ya tovên dermankirî yên ku 7 rojan di navgîna MS de bi an bêyî 200 μM kumamonamîd û pêkhateyên têkildar hatine înkubasyon kirin. Stêrk cûdahiyên girîng bi dermankirina sexte re nîşan didin (testê chi-square). n=96.
Bi balkêşî, lêzêdekirina zincîrên alî yên alkîl ên ji C9 dirêjtir çalakiya astengker kêm kir, ev yek jî nîşan dide ku pêkhateyên têkildar ên asîda kumamotoîk ji bo nîşandana çalakiya xwe ya biyolojîkî hewceyê zincîrên alî yên bi mezinahiyek diyarkirî ne.
Ji ber ku analîza têkiliya avahî-çalakiyê nîşan da ku C9 bo asîda ursonîk hatiye guhertin û derivatîfa nonyloxy ya asîda ursonîk (ku ji vir û pê ve wekî KAND 11 tê binavkirin) astengkerê mezinbûna nebatan ê herî bibandor bû, me karakterîzasyonek berfirehtir a KAND 11 pêk anî. Dermankirina Arabidopsis bi 50 μM KAND 11 hema hema bi tevahî rê li ber geşbûnê girt, lê belê konsantrasyonên kêmtir (40, 30, 20, an 10 μM) yên KAND 11 mezinbûna reh bi awayekî girêdayî dozê asteng kir (Wêne 4a, b). Ji bo ceribandina ka KAND 11 bandorê li ser zindîbûna merîstema reh dike, me merîstemên reh ên ku bi propidium iodide (PI) hatine boyaxkirin lêkolîn kirin û mezinahiya qada merîstemê pîvand. Mezinahiya merîstema şitlên ku li ser navgînek ku 25 μM KAND-11 tê de heye mezin bûne 151.1 ± 32.5 μm bû, lê mezinahiya merîstema şitlên ku li ser navgînek kontrolê ku DMSO tê de heye mezin bûne 264.7 ± 30.8 μm bû (Wêne 4c, d), ku nîşan dide ku KAND-11 çalakiya hucreyî sererast dike. belavbûn. Merîstema kokê. Li gorî vê, dermankirina KAND 11 mîqdara nîşana dabeşkirina hucreyê CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS di merîstema kokê de kêm kir (Wêne 4e) 17. Ev encam nîşan didin ku KAND 11 bi kêmkirina çalakiya zêdebûna hucreyê mezinbûna kokê asteng dike.
Analîza bandora astengker a derivatîfên asîda urbenonîk (deravîtên urbenyloksî) li ser mezinbûnê. (a) Nebatên Col ên cureyê kovî yên 7 rojî yên ku li ser plakayên MS bi konsantrasyonên KAND 11 ên destnîşankirî hatine çandin. Şêweya pîvanê = 1 cm. (b) Pîvana dirêjahiya reh. Tîp cûdahiyên girîng nîşan didin (Testa Tukey HSD, p< 0.05). n>16. Daneyên wekî navînî ± SD têne nîşandan. (c) Mîkroskopiya konfokal a rehên Col ên celebê kovî yên bi propidium iodide boyaxkirî yên ku li ser plakayên MS bi an bêyî 25 μM KAND 11 mezin bûne. Kelepçeyên spî meristema kokê nîşan didin. Şêweya pîvanê = 100 µm. (d) Pîvana mezinahiya meristema kokê (n = 10 heta 11). Cûdahiyên îstatîstîkî bi karanîna testa t-yê hatin destnîşankirin (p< 0.05). Xêz mezinahiya navînî ya merîstemê temsîl dikin. (e) Mîkroskopiya kontrastê ya destwerdana cûdahiyê (DIC) ya merîstemek kokê ku avahiya CDKB2 tê de heye; 1pro: CDKB2; 1-GUS li ser nebatên 5 rojî yên ku li ser plakayên MS bi an bêyî ceribandina 25 µM KAND mezin bûne, hatine boyaxkirin û boyaxkirin.
Fîtotoksîsîteya KAND 11 bi karanîna nebatek din a dîkotîledon, titûn (Nicotiana tabacum), û organîzmayek modela nebata bejayî ya sereke, kezeba sor (Marchantia polymorpha) hate ceribandin. Wekî di rewşa Arabidopsis de, şitlên titûnê SR-1 ên ku li ser medyayek ku 25 μM KAND 11 tê de hebû mezin bûn, rehên kurttir çêkirin (Wêne 5a). Wekî din, 40 ji 48 tovan li ser lewheyên ku 200 μM KAND 11 tê de hebûn, şîn bûn, lê hemî 48 tov li ser medyayek sexte ya dermankirî şîn bûn, ku nîşan dide ku rêjeyên bilindtir ên KAND girîng bûn (p< 0.05; testa chi -square) geşbûna titûnê asteng kir. (Wêne 5b). Wekî din, rêjeya KAND 11 ku mezinbûna bakteriyan di kezeba sor de asteng kir, dişibiya rêjeya bi bandor a di Arabidopsis de (Wêne 5c). Ev encam nîşan didin ku KAND 11 dikare mezinbûna cûrbecûr nebatan asteng bike. Piştre me li ser sîtotoksîsîteya gengaz a pêkhateyên monoamîd ên bi hirçê ve girêdayî di organîzmayên din de, ango hucreyên HeLa yên mirovan û cureya Escherichia coli DH5α, wekî nûnerên hucreyên heywanan û bakteriyan ên bilind, bi rêzê ve, lêkolîn kir. Di rêze ceribandinên zêdebûna hucreyan de, me dît ku kumamonamîd 1, asîda kumamonamîd 6, û KAND 11 di rêjeya 100 μM de bandor li mezinbûna hucreyên HeLa an E. coli nekir (Wêne 5d,e).
Astengkirina mezinbûna KAND 11 di organîzmayên ne-Arabidopsis de. (a) Şitilên titûnê yên SR-1 ên du hefteyî li ser plakayên MS yên bi cihkirî yên vertîkal ên ku 25 μM KAND 11 tê de hene hatin çandin. (b) Şitilên titûnê yên SR-1 ên du hefteyî li ser plakayên MS yên bi cihkirî yên horizontal ên ku 200 μM KAND 11 tê de hene hatin çandin. (c) Kulîlkên kezeba Tak-1 ên du hefteyî yên ku li ser plakayên Gamborg B5 bi konsantrasyonên KAND 11 ên destnîşankirî hatine çandin. Tîrên sor sporên ku di nav du hefteyan de mezinbûna xwe rawestandiye nîşan didin. (d) Testa zêdebûna hucreyê ya hucreyên HeLa. Hejmara hucreyên zindî di navberên demên diyarkirî de bi karanîna kîta hejmartina hucreyê 8 (Dojindo) hate pîvandin. Wekî kontrol, hucreyên HeLa bi 5 μg/ml aktînomîsîn D (Act D) hatin dermankirin, ku transkrîpsiyona RNA polîmeraz asteng dike û dibe sedema mirina hucreyê. Analîz sê caran hatin kirin. (e) Testa zêdebûna hucreya E. coli. Mezinbûna E. coli bi pîvandina OD600 hate analîzkirin. Wekî kontrol, hucre bi 50 μg/ml ampîsîlîn (Amp) hatin dermankirin, ku senteza dîwarê şaneya bakteriyan asteng dike. Analîz sê caran hatin kirin.
Ji bo şirovekirina mekanîzmaya çalakiya sîtotoksîsîteyê ya ji ber pêkhateyên bi uramîdê ve girêdayî, me derivatîfên asîda urbenic bi bandorên astengker ên nerm ji nû ve analîz kirin, wekî ku di wêneyê de tê xuyang kirin. Wekî ku di Wêneyên 2b, 6a de tê xuyang kirin, nebatên ku li ser plakayên agarê yên ku tê de rêjeyên bilind (200 μM) asîda urmotonîk 6 hene mezin bûn, rehên kurttir û çep-qelişî hilberandin (θ = – 23.7 ± 6.1), lê ji nebatên ku li ser navgîniya kontrolê mezin bûne, nebatan rehên hema hema rasterast hilberandin (θ = – 3.8 ± 7.1). Ev mezinbûna oblîk a taybetmendî wekî encama nefonksiyona mîkrotubulên kortîkal tê zanîn14,18. Li gorî vê dîtinê, dermanên bêîstîqrarkirina mîkrotubulan disopyramide û oryzalin di bin şert û mercên mezinbûna me de meylkirina rehên wekhev çêkirin (Wêne 2b, 6a). Di heman demê de, me derivatîfên asîda urmotonîk ceribandin û çend ji wan hilbijartin ku, di hin rêjeyan de, mezinbûna rehên oblîk çêkirin. Têkelên 8, 9, û 15 rêça mezinbûna reh bi rêzê ve li 75 μM, 50 μM, û 40 μM guhertin, ku nîşan dide ku ev têkel dikarin bi bandor mîkrotubulan bêîstîqrar bikin (Wêne 2b, 6a). Me her weha derivatîfa asîda ursolîk a herî bihêz, KAND 11, di rêjeyek kêmtir de (15 µM) ceriband û dît ku sepandina KAND 11 mezinbûna reh asteng dike û rêça mezinbûna reh ne yekreng e, her çend ew meyla wan ber bi çepê ve diçûn (Wêne C3). . Ji ber ku rêjeyên bilindtir ên dermanên bêîstîqrarkirina mîkrotubulan carinan mezinbûna nebatan asteng dikin ne ku dibin sedema xwarbûna reh, me paşê îhtîmala ku KAND 11 bandorê li mîkrotubulan dike bi çavdêriya mîkrotubulên kortîkal di hucreyên epidermal ên reh de nirxand. Îmûnohîstokîmya bi karanîna antîkorên antî-β-tubulin di hucreyên epidermal ên rehên nebatan ên ku bi 25 μM KAND 11 hatine dermankirin de windabûna hema hema hemî mîkrotubulên kortîkal di hucreyên epidermal de di herêma dirêjkirinê de nîşan da (Wêne 6b). Ev encam nîşan didin ku asîda kumamotonîk û derivatîfên wê rasterast an nerasterast li ser mîkrotubulan tevdigerin û wan têk dibin û ev pêkhate înhibitorên mîkrotubulan ên nû ne.
Asîda Ursonîk û derivatên wê mîkrotubulên kortîkal di Arabidopsis thaliana de diguherînin. (a) Goşeya meyldariya kokê di hebûna derivatên cûrbecûr ên asîda urmotonîk de di rêjeyên destnîşankirî de hatî pîvandin. Bandorên du pêkhateyên ku têne zanîn ku mîkrotubulan asteng dikin: disopyramide û oryzalin jî hatin analîzkirin. Wêneya hundurîn standarda ku ji bo pîvandina goşeya mezinbûna kokê tê bikar anîn nîşan dide. Stêrk cûdahiyên girîng bi dermankirina sexte re nîşan didin (test t, p< 0.05). n>19. Pîvana xêz = 1 cm. (b) Mîkrotubulên kortîkal di hucreyên epidermal de di herêma dirêjkirinê de. Mîkrotubul di kokên Arabidopsis Col ên cureyê kovî de ku li ser plakayên MS bi an bêyî 25 μM KAND 11 mezin bûne, bi boyaxkirina îmmunohîstokîmyayî bi karanîna antîkorên seretayî yên β-tubulin û antîkorên duyemîn ên bi Alexa Fluor ve girêdayî hatine xuyang kirin. Pîvana xêz = 10 µm. (c) Avahiya mîtotîk a mîkrotubulan di merîstema kokê de. Mîkrotubul bi karanîna boyaxkirina îmmunohîstokîmyayî hatin xuyang kirin. Avahiya mîtotîk, di nav de herêmên profaz, mil û fragmoplast, ji wêneyên konfokal hatin jimartin. Tîr avahiyên mîkrotubulên mîtotîk nîşan didin. Stêrk cûdahiyên girîng bi dermankirina sexte nîşan didin (test t, p< 0.05). n>9. Pîvana xêz = 50 µm.
Her çend Ursa xwedî şiyana têkbirina fonksiyona mîkrotubulê be jî, tê payîn ku mekanîzmaya çalakiya wê ji ajanên depolimerizandina mîkrotubulê yên tîpîk cuda be. Bo nimûne, konsantrasyonên bilindtir ên ajanên depolimerizandina mîkrotubulê yên wekî dîsopîramîd û orîzalîn berfirehbûna anîzotropîk a şaneyên epidermalê çêdikin, lê KAND 11 na. Wekî din, sepandina hevbeş a KAND 11 û dîsopîramîdê bû sedema bersiveke mezinbûna kokê ya bi dîsopîramîdê ve girêdayî û astengkirina mezinbûna bi KAND 11 ve girêdayî hate dîtin (Wêne S4). Me her wiha bersiva mutantê dîsopîramîd 1-1 (phs1-1) yê hesas li hember KAND 11 analîz kir. phs1-1 xwedî mutasyoneke xala kînaza tubulinê ya ne-kanonîk e û dema ku bi dîsopîramîdê tê dermankirin kokên kurttir çêdike9,20. şitlên mutant phs1-1 ên ku li ser medyaya agarê ya ku KAND 11 tê de heye mezin dibin, kokên kurttir hebûn ku dişibin yên ku li ser dîsopîramîdê mezin dibin (wêne S5).
Herwiha, me di merîstema kokê ya nebatên ku bi KAND 11 hatine dermankirin de avahiyên mîkrotubulên mîtotîk, wekî herêmên profaz, milên piçûk û fragmoplast dîtin. Li gorî çavdêriyên ji bo CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, kêmbûnek girîng di hejmara mîkrotubulên mîtotîk de hate dîtin (Wêne .6c).
Ji bo destnîşankirina sîtotoksîsîteya KAND 11 di çareseriya binhucreyî de, me şaneyên daliqandina BY-2 yên titûnê bi KAND 11 derman kirin û bersiva wan çavdêrî kirin. Me pêşî KAND 11 li şaneyên BY-2 yên ku TagRFP-TUA6, ku mîkrotubulan bi floresan nîşan dike, îfade dikin zêde kir da ku bandora KAND 11 li ser mîkrotubulên kortîkal binirxînin. Densiya mîkrotubulên kortîkal bi karanîna analîza wêneyê hate nirxandin, ku rêjeya pîkselên sîtoskeletê di nav pîkselên sîtoplazmayî de pîvand. Encamên ceribandinê nîşan dan ku piştî dermankirinê bi 50 μM an 100 μM KAND 11 ji bo 1 saetê, densîtî bi girîngî kêm bû û gihîşt 0.94 ± 0.74% an 0.23 ± 0.28%, di heman demê de densiya şaneyên ku bi DMSO hatine dermankirin gihîşt 1.61 ± 0.34% (Wêne 7a). Ev encam bi çavdêriya di Arabidopsis de lihevhatî ne ku dermankirina KAND 11 depolîmerîzasyona mîkrotubulên kortîkal teşwîq dike (Wêne 6b). Me xeta BY-2 bi fîlamentên aktînê yên bi GFP-ABD-nîşankirî piştî dermankirinê bi heman rêjeya KAND 11 ve lêkolîn kir û dît ku dermankirina KAND 11 fîlamentên aktînê têk bir. Dermankirina bi 50 μM an 100 μM KAND 11 ji bo 1 demjimêrê dendika fîlamentên aktînê bi girîngî kêm kir heta 1.20 ± 0.62% an 0.61 ± 0.26%, lê dendika di hucreyên ku bi DMSO hatine dermankirin de 1.69 ± 0.51% bû (Wêne 2). 7b). Ev encam bi bandorên propîzamîdê re nakok in, ku bandorê li fîlamentên aktînê nake, û latrunculin B, depolimerizatorek aktînê ku bandorê li mîkrotubulan nake (Wêneya SI S6). Wekî din, dermankirina bi kumamonamîd 1, asîda kumamonamîd 6, an KAND 11 bandorê li mîkrotubulên di hucreyên HeLa de nekir (Wêneya SI S7). Ji ber vê yekê, tê bawerkirin ku mekanîzmaya çalakiya KAND 11 ji ya têkderên sîtoskeletê yên naskirî cuda ye. Wekî din, çavdêriya me ya mîkroskopîk a hucreyên BY-2 yên ku bi KAND 11 hatine dermankirin, destpêka mirina hucreyan di dema dermankirina KAND 11 de eşkere kir û nîşan da ku rêjeya hucreyên mirî yên bi rengê şîn ê Evans piştî 30 hûrdem dermankirina KAND 11 bi girîngî zêde nebûye, lê piştî 90 hûrdem dermankirinê bi 50 μM an 100 μM KAND, hejmara hucreyên mirî bi rêzê ve gihîştiye 43.7% an 80.1% (Wêne 7c). Bi hev re, ev daneyên nîşan didin ku derivatîfa asîda ursolîk a nû KAND 11 astengkerek sîtoskeletê ya taybetî ya nebatan e ku mekanîzmayek çalakiyê ya berê nenas heye.
KAND bandorê li mîkrotubulên kortîkal, fîlamentên aktînê, û zindîbûna şaneyên BY-2 yên titûnê dike. (a) Dîtbarîkirina mîkrotubulên kortîkal di şaneyên BY-2 de di hebûna TagRFP-TUA6 de. Şaneyên BY-2 yên ku bi KAND 11 (50 μM an 100 μM) an DMSO hatine dermankirin bi mîkroskopiya konfokal hatin lêkolînkirin. Densiya mîkrotubulên kortîkal ji mîkrografên 25 şaneyên serbixwe hate hesabkirin. Tîp cûdahiyên girîng nîşan didin (Testa Tukey HSD, p< 0.05). Pîvana xêz = 10 µm. (b) Têlên aktîna kortîkal di hucreyên BY-2 de ku di hebûna GFP-ABD2 de têne xuyang kirin. Hucreyên BY-2 yên ku bi KAND 11 (50 μM an 100 μM) an DMSO hatine dermankirin bi mîkroskopiya konfokal hatin lêkolîn kirin. Tîrbûna têlên aktîna kortîkal ji mîkrografên 25 hucreyên serbixwe hate hesab kirin. Tîp cûdahiyên girîng nîşan didin (Testa Tukey HSD, p< 0.05). Pîvana xêzikê = 10 µm. (c) Çavdêriya şaneyên BY-2 yên mirî bi boyaxkirina şîn a Evans. Şaneyên BY-2 yên ku bi KAND 11 (50 μM an 100 μM) an DMSO hatine dermankirin bi mîkroskopiya zeviya geş hatin lêkolînkirin. n=3. Pîvana xêzikê = 100 µm.
Vedîtin û sepandina berhemên xwezayî yên nû di gelek aliyên jiyana mirovan de, di nav de bijîşkî û çandinî, bûye sedema pêşketinên girîng. Lêkolînên dîrokî ji bo bidestxistina pêkhateyên bikêr ji çavkaniyên xwezayî hatine kirin. Bi taybetî, aktînomîset wekî antîbiyotîkên antîparazît ji bo nematodan bikêr têne zanîn ji ber ku ew dikarin metabolîtên duyemîn ên cûrbecûr ên wekî avermektîn, pêkhateya sereke ya îvermektîn û bleomîsîn û derivatên wê hilberînin, ku di dermanan de wekî ajanek dijî-penceşêrê têne bikar anîn21,22. Bi heman awayî, cûrbecûr pêkhateyên gihayî ji aktînomîsetan hatine kifş kirin, ku hin ji wan jixwe bi bazirganî têne bikar anîn1,23. Ji ber vê yekê, analîzkirina metabolîtên aktînomîset ji bo veqetandina berhemên xwezayî bi çalakiyên biyolojîkî yên xwestî wekî stratejiyek bi bandor tê hesibandin. Di vê lêkolînê de, me pêkhateyek nû, kuumamonamîd, ji S. werraensis kifş kir û bi serkeftî ew sentez kir. Asîda Ursonîk navbeynkarek sentetîk a urbenamîd û derivatên wê ye. Ew dikare bibe sedema pêçandina kokê ya taybetmend, çalakiya gihayî ya nerm heta bihêz nîşan bide, û rasterast an nerasterast zirarê bide mîkrotubulên nebatan. Lêbelê, mekanîzmaya çalakiya asîda urmotonîk dibe ku ji ya astengkerên mîkrotubulên heyî cuda be, ji ber ku KAND 11 di heman demê de fîlamentên aktînê jî têk dide û dibe sedema mirina hucreyê, ku mekanîzmayek rêkûpêk pêşniyar dike ku bi wê re asîda urmotonîk û derivatîfên wê bandorê li rêzek fireh ji avahiyên sîtoskeletê dikin.
Taybetmendiya berfirehtir a asîda urbenonîk dê ji bo têgihîştina mekanîzmaya çalakiya asîda urbenonîk çêtir bibe alîkar. Bi taybetî, armanca din ew e ku şiyana asîda ursonîk a girêdana bi mîkrotubulên kêmkirî were nirxandin da ku were destnîşankirin ka asîda ursonîk û derivatên wê rasterast li ser mîkrotubulan tevdigerin û wan depolîmerîze dikin, an jî çalakiya wan dibe sedema bêîstîqrariya mîkrotubulan. Wekî din, di rewşa ku mîkrotubul ne hedefek rasterast in, destnîşankirina cîhê çalakiyê û hedefên molekulî yên asîda ursonîk li ser şaneyên nebatan dê ji bo têgihîştina taybetmendiyên pêkhateyên têkildar û rêbazên gengaz ên baştirkirina çalakiya herbisîd bêtir bibe alîkar. Testa me ya biyoaktîvîteyê şiyana sîtotoksîk a bêhempa ya asîda ursonîk li ser mezinbûna nebatan wekî Arabidopsis thaliana, titûn û kezeba sor eşkere kir, di heman demê de ne hucreyên E. coli û ne jî HeLa bandor bûn. Jehrbûna hindik an tunebûna jehrê ji bo şaneyên heywanan avantajek ji derivatên asîda ursonîk e ger ew wekî herbisîd ji bo karanîna li zeviyên çandiniyê yên vekirî werin pêşve xistin. Bi rastî, ji ber ku mîkrotubul di eukaryotan de avahiyên hevpar in, astengkirina wan a bijartî di nebatan de şertek sereke ji bo herbisîd e. Bo nimûne, propîzamîd, ajanek depolîmerîzasyona mîkrotubulê ye ku rasterast bi tubulînê ve girêdide û polîmerîzasyonê asteng dike, ji ber jehrîbûna wê ya kêm ji bo şaneyên heywanan wekî herbisîtek tê bikar anîn24. Berevajî dîsopîramîdê, benzamîdên têkildar xwedî taybetmendiyên hedef ên cûda ne. Ji bilî mîkrotubulên nebatan, RH-4032 an benzoksamîd jî mîkrotubulên şaneyên heywanan an oomîsetan asteng dike, û zalîlamîd ji ber fîtotoksîbûna wê ya kêm wekî fungîsîdek tê bikar anîn25,26,27. Hirçê nû hatî keşifkirin û derivatên wê sîtotoksîsîteya bijartî li dijî nebatan nîşan didin, lê hêjayî gotinê ye ku guhertinên din dikarin taybetmendiya armanca wan biguherînin, ku potansiyel derivatên zêde ji bo kontrolkirina fungên nexweşî an oomîsetan peyda bikin.
Taybetmendiyên bêhempa yên asîda urbenonîk û derivatîfên wê ji bo pêşveçûna wan wekî herbisîd û karanîna wan wekî amûrên lêkolînê kêrhatî ne. Girîngiya sîtoskeletonê di kontrolkirina şeklê hucreya nebatan de bi berfirehî tê nas kirin. Lêkolînên berê nîşan dane ku nebatan bi kontrolkirina dînamîkên mîkrotubulê da ku morfogenezê bi rêkûpêk kontrol bikin, mekanîzmayên tevlihev ên rêxistina mîkrotubulên kortîkal pêş xistine. Hejmareke mezin ji molekulên berpirsiyar ji bo rêkxistina çalakiya mîkrotubulê hatine destnîşankirin, û lêkolînên têkildar hîn jî berdewam in3,4,28. Têgihîştina me ya heyî ya dînamîkên mîkrotubulê di hucreyên nebatan de bi tevahî mekanîzmayên rêxistina mîkrotubulên kortîkal rave nake. Mînakî, her çend hem dîsopîramîd û hem jî orîzalîn dikarin mîkrotubulan depolîmerîze bikin jî, dîsopîramîd dibe sedema xirabûna giran a kokê dema ku orîzalîn bandorek nisbeten sivik heye. Wekî din, mutasyonên di tubulînê de, ku mîkrotubulan sabît dike, di heman demê de dibe sedema dekstrorotasyonê di kokan de, lê paklîtaksel, ku dînamîkên mîkrotubulê jî sabît dike, nake. Ji ber vê yekê, lêkolîn û destnîşankirina hedefên molekulî yên asîda ursolîk divê têgihiştinên nû li ser rêkxistina mîkrotubulên kortîkal ên nebatan peyda bike. Bi heman awayî, berawirdkirinên pêşerojê yên kîmyewîyên ku di pêşvebirina mezinbûna xirab de bi bandor in, wek disopyramide, û kîmyewîyên kêmtir bi bandor, wek oryzalin an asîda kumamotoric, dê nîşanan bidin ka mezinbûna xirab çawa çêdibe.
Ji aliyekî din ve, ji nû ve rêzkirina sîtoskeletê ya têkildarî parastinê îhtîmalek din e ji bo ravekirina sîtotoksîsîteya asîda ursonîk. Enfeksiyona patojenek an jî danasîna elîktorek nav şaneyên nebatan carinan dibe sedema hilweşîna sîtoskeletê û paşê mirina şaneyê29. Bo nimûne, hatiye ragihandin ku krîptoksantîn ji oomycete hatî wergirtin mîkrotubul û fîlamentên aktînê berî mirina şaneyên titûnê têk dide, mîna ya ku bi dermankirina KAND re diqewime30,31. Dişibiyên di navbera bersivên parastinê û bersivên şaneyê yên ji hêla asîda ursonîk ve têne çêkirin de me hîpotez kir ku ew pêvajoyên şaneyê yên hevpar didin destpêkirin, her çend bandorek zûtir û bihêztir a asîda ursonîk ji krîptoksantîn eşkere ye. Lêbelê, lêkolînan nîşan dane ku têkçûna fîlamentên aktînê mirina şaneyê ya xweber pêş dixe, ku ne her gav bi têkçûna mîkrotubulê re tê29. Wekî din, hîn jî nayê dîtin ka patojen an elîktor mezinbûna kokê ya xirabkirî çêdike, wekî ku derivatên asîda ursonîk dikin. Bi vî rengî, zanîna molekulî ya ku bersivên parastinê û sîtoskeletê bi hev ve girêdide pirsgirêkek balkêş e ku were çareser kirin. Bi sûdwergirtina ji hebûna pêkhateyên giraniya molekulî ya kêm ên bi asîda ursonîk ve girêdayî, û her weha rêzek derivatîfên bi hêzên cûda, ew dikarin derfetan peyda bikin da ku mekanîzmayên hucreyî yên nenas hedef bigirin.
Bi hev re, vedîtin û sepandina pêkhateyên nû yên ku dînamîkên mîkrotubulan modüle dikin dê rêbazên bihêz peyda bike da ku mekanîzmayên molekulî yên tevlihev ên di bingeha destnîşankirina şeklê hucreya nebatan de çareser bike. Di vê çarçoveyê de, pêkhateya vê dawiyê ya asîda urmotonîk, ku bandorê li mîkrotubul û fîlamentên aktînê dike û dibe sedema mirina hucreyê, dibe ku derfetek peyda bike da ku têkiliya di navbera kontrola mîkrotubulan û van mekanîzmayên din de were şîrovekirin. Bi vî rengî, analîza kîmyewî û biyolojîkî bi karanîna asîda urbenonîk dê ji me re bibe alîkar ku em mekanîzmayên rêkxistina molekulî yên ku sîtoskeleta nebatan kontrol dikin fam bikin.
S. werraensis MK493-CF1 têxin nav firaxek Erlenmeyer a 500 mL ya bi bafl ku 110 mL ji navgîna tovê pêk tê ji 2% (w/v) galaktoz, 2% (w/v) pasta Essence, 1% (w/v) pêkhateya Bacto. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) ekstrakta ceh (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonya), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 û 0.2% CaCO3 di ava bêîyonîze de. (pH 7.4 berî sterîlîzasyonê). Kulturên tovê li ser hejkerek zivirî (180 rpm) di 27°C de ji bo 2 rojan hatin înkubasyon kirin. Çandiniya hilberînê bi rêya fermentasyona rewşa hişk. Çanda tov (7 ml) hate veguheztin nav şûşeyek K-1 a 500 ml ku tê de 40 g navgîniya hilberînê hebû ku ji 15 g cehê pêçayî (MUSO Co., Ltd., Japonya) û 25 g ava deîyonîzekirî (pH berî sterîlîzasyonê nehatiye sererastkirin). Fermentasyon di 30°C de di tariyê de ji bo 14 rojan hate kirin. Materyalê fermentasyonê bi 40 ml/şûşe EtOH hate derxistin û santrifûj kirin (1500 g, 4°C, 10 deqe). Sermaya çandiniyê (60 ml) bi tevliheviyek ji %10 MeOH/EtOAc hate derxistin. Qata organîk di bin zexta kêmkirî de hate buharkirin da ku bermahiyek (59.5 mg) were bidestxistin, ku li ser stûnek qonaxa berevajî (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × dirêjahî 250 mm) bi HPLC-ê re bi elusyona gradient (0-10 deqe: 90%) hate ceribandin. H2O/CH3CN, 10-35 deqe: 90% H2O/CH3CN heta 70% H2O/CH3CN (gradient), 35-45 deqe: 90% H2O/EtOH, 45-155 deqe: 90% H2O/EtOH heta 100% EtOH (gradient (gradient), 155-200 deqe: 100% EtOH) bi rêjeya herikîna 1.5 ml/deqe, kumamonamîd (1, 36.0 mg) wekî tozek amorf a spî hate veqetandin.
Kumamotoamîd(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: Nirxa hesabkirî ya [C6H9N2O2]+: 141.0659, nirxa pîvandî: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Tovên Kolombiyayê (Col-0) ji Navenda Çavkaniyên Biyolojîkî ya Arabidopsis (ABRC) bi destûra karanîna lêkolînê hatin wergirtin. Tovên Col-0 di bin şert û mercên laboratûara me de hatin belavkirin û parastin û wekî nebatên Arabidopsis ên cureyê kovî hatin bikar anîn. Tovên Arabidopsis li ser rûyê erdê hatin sterîlkirin û di navgînek nîv-hêz a Murashige û Skoog de ku tê de 2% sukroz (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) asîda 2-(4-morfolîno)etansulfonîk (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) û 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, li 23 °C û ronahiya domdar heye, hatin çandin. Tovên mutanta phs1-1 ji hêla T. Hashimoto (Enstîtuya Zanist û Teknolojiyê ya Nara) ve hatin peyda kirin.
Tovên cureya SR-1 ji aliyê T. Hashimoto (Enstîtuya Zanist û Teknolojiyê ya Nara) ve hatin peyda kirin û wekî nebatên titûnê yên cureya kovî hatin bikar anîn. Tovên titûnê ji bo pêşvebirina şînbûnê sê şevan li ser rûyê erdê hatin sterîl kirin û di ava sterîl de hatin hiştin, dûv re di çareseriyek nîv-hêz de hatin danîn ku tê de 2% sukroz, 0.05% (w/v) MES, û 0.8% goma gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. û Skoog medium) bi pH 5.7 û di 23°C de di bin ronahiya domdar de hatin înkubasyon kirin.
Cureyê Tak-1 ji hêla T. Kohchi (Zanîngeha Kyoto) ve hat peyda kirin û wekî yekîneya ceribandinê ya standard ji bo lêkolîna kezeba sor hat bikar anîn. Gemma ji nebatan çandinî yên sterîlkirî hat wergirtin û dûv re li ser medyaya Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) ku 1% sukroz û 0.3% goma gellan tê de hebû hat çandin û di 23°C de di bin ronahiya domdar de hat înkubasyon kirin.
Xaneyên BY-2 yên titûnê (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ji hêla S. Hasezawa (Zanîngeha Tokyo) ve hatine peyda kirin. Xaneyên BY-2 di navgîna Linsmeier û Skoog a guherandî de 95 qat hatin şilkirin û heftane bi asîda 2,4-dîklorofenoksîasetîk 32 hatin zêdekirin. Suspensiyona xaneyan li ser hejkerek zivirî di 130 rpm de di 27°C de di tariyê de hate tevlihev kirin. Xaneyan bi 10 qat ji mîqdara navgîna teze bişon û di heman navgînê de ji nû ve suspen bikin. Xetên xaneya transgenîk ên BY-2 ku nîşankera mîkrotubulê TagRFP-TUA6 an nîşankera fîlamenta aktînê GFP-ABD2 di bin pêşvebira vîrusa mozaîka kulîlkê 35S de bi awayekî stabîl îfade dikin, wekî ku hatiye vegotin hatine çêkirin33,34,35. Ev xetên xaneyan dikarin bi karanîna prosedurên mîna yên ku ji bo xeta xaneya BY-2 ya orîjînal hatine bikar anîn werin parastin û senkronîze kirin.
Hucreyên HeLa di navgîna Eagle ya guhertî ya Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) de ku bi %10 seruma fetal a ga, 1.2 U/ml penisîlîn û 1.2 μg/ml streptomîsîn lê hatiye zêdekirin, di înkubatorek 37°C de bi %5 CO2 hatin çandin.
Hemû ceribandinên ku di vê destnivîsê de hatine vegotin li gorî rêzikname û rêbernameyên ewlehiya biyolojîk ên Japonî hatine kirin.
Têkel wekî çareseriyên stok di dimetil sulfoksîd (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) de hatin çareserkirin û di navgîna MS de ji bo Arabidopsis û titûnê an jî di navgîna Gamborg B5 de ji bo kezeba sor hatin şilkirin. Ji bo ceribandina astengkirina mezinbûna reh, ji her plakeyê zêdetirî 10 tov li ser navgîna agarê ku tê de têkelên diyarkirî an DMSO hene hatin çandin. Tov di odeya mezinbûnê de 7 rojan hatin înkubasyonkirin. Wêneyên şitlan hatin kişandin û dirêjahiya kokan hat pîvandin. Ji bo ceribandina şînbûna Arabidopsis, 48 tov li ser her plakeyê li ser navgîna agarê ku tê de 200 μM têkel an DMSO heye hatin çandin. Tovên Arabidopsis di odeya mezinbûnê de hatin çandin û hejmara şitlên şînbûyî 7 roj piştî şînbûnê (dag) hat jimartin. Ji bo ceribandina şînbûna titûnê, 24 tov li ser her plakeyê li ser navgîna agarê ku tê de 200 μM KAND an DMSO heye hatin çandin. Tovên titûnê di odeya mezinbûnê de hatin çandin û hejmara şitlên şînbûyî piştî 14 rojan hat jimartin. Ji bo ceribandina astengkirina mezinbûna kezeba sipî, 9 embrîyo ji her plakeyê li ser medyaya agarê hatin çandin ku tê de rêjeyên diyarkirî yên KAND an DMSO hene û 14 rojan di odeya mezinbûnê de hatin înkubasyonkirin.
Ji bo dîtina rêxistina meristema kokê, şitlên ku bi 5 mg/ml propidium iodide (PI) hatine boyaxkirin bikar bînin. Sînyalên PI bi mîkroskopiya flûoresansê bi karanîna mîkroskopa şopandina lazer a konfokal a TCS SPE (Leica Microsystems) hatin çavdêrîkirin.
Boyaxkirina hîstokîmyayî ya rehên kokan bi β-glukuronidase (GUS) li gorî protokola ku ji hêla Malami û Benfey36 ve hatî vegotin hate kirin. Şitl şevekê di nav %90 aseton de hatin sabît kirin, bi 0.5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolyl-β-d-glukuronîk asîd di tampona GUS de ji bo 1 saetê hatin boyaxkirin û di çareseriyek kloraldehîda hîdratkirî de hatin danîn. (8 g kloral hîdrat, 2 ml av û 1 ml glîserol) û bi mîkroskopiya kontrastê ya destwerdana cûdahiyê bi karanîna mîkroskopa Axio Imager M1 (Carl Zeiss) hatin çavdêrîkirin.
Goşeyên reh li ser şitlên 7 rojî yên ku li ser lewheyên bi awayekî vertîkal hatine danîn hatine pîvandin. Goşeya reh ji aliyê vektora gravîtasyonê ve wekî ku di gava 6-an de hatiye vegotin bipîvin.
Rêzkirina mîkrotubulên kortîkal wekî ku hatiye vegotin, bi guhertinên piçûk di protokolê de 37 hate çavdêrîkirin. Antîkorê antî-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) û antî-mişk IgG ya bi Alexa Fluor 488 ve girêdayî (Thermo Fisher Scientific: A32723) wekî antîkorên seretayî û duyemîn bi rêzê ve di rêjeyên 1:1000 û 1:100 de hatin bikar anîn. Wêneyên flûoresansê bi karanîna mîkroskopa şopandina lazer a konfokal a TCS SPE (Leica Microsystems) hatin bidestxistin. Wêneyên Z-stack li gorî rêwerzên çêker bi dest bixin û projeksiyonên şîddeta herî zêde biafirînin.
Testa zêdebûna hucreya HeLa bi karanîna Cell Counting Kit 8 (Dojindo) li gorî rêwerzên çêker hate kirin.
Mezinbûna E. coli DH5α bi pîvandina dendika şaneyan di kulturê de bi karanîna spektrofotometreyek li 600 nm (OD600) hate analîzkirin.
Rêxistina sîtoskeletê di hucreyên transgenîk BY-2 de bi karanîna mîkroskopa flûoresansê ya ku bi amûrek şopandina konfokal a CSU-X1 (Yokogawa) û kamerayek sCMOS (Zyla, Andor Technology) ve hatî çêkirin, hate çavdêrîkirin. Densiya sîtoskeletê bi analîza wêneyê hate nirxandin, ku rêjeya pîkselên sîtoskeletê di nav pîkselên sîtoplazmayî de di wêneyên konfokal de bi karanîna nermalava ImageJ wekî ku hatî vegotin pîvand38,39.
Ji bo tespîtkirina mirina şaneyan di şaneyên BY-2 de, alîkîtotek ji rawestandina şaneyan bi 0.05% şîna Evans re ji bo 10 hûrdeman di germahiya odeyê de hate înkubekirin. Boyaxkirina bijartî ya şîna Evans a şaneyên mirî bi derxistina boyaxê ji şaneyên zindî ji hêla membrana plazmaya saxlem ve girêdayî ye40. Şaneyên boyaxkirî bi karanîna mîkroskopa zeviya geş (BX53, Olympus) hatin çavdêrîkirin.
Hucreyên HeLa di DMEMê de ku bi %10 FBS lê hatiye zêdekirin, di înkubatorekî şilkirî de di 37°C û %5 CO2 de hatin mezin kirin. Hucre bi 100 μM KAND 11, asîda kumamonamîk 6, kumamonamîd 1, 100 ng/ml kolcemîd (Gibco), an 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) ji bo 6 demjimêran li 37°C hatin dermankirin. Hucre bi MetOH ji bo 10 hûrdeman û dûv re bi asetat ji bo 5 hûrdeman li germahiya odeyê hatin sabît kirin. Hucreyên sabît bi antîkorê seretayî β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) ku di %0.5 BSA/PBS de ji bo 2 demjimêran hatiye şilkirin, 3 caran bi TBST hatin şuştin, û dûv re bi antîkorê bizinê Alexa Fluor hatin înkubasyon kirin. 488 1 demjimêr. – IgG ya mişk (Thermo Fisher Scientific: A11001) û 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) di 0.5% BSA/PBS de hatiye şilkirin. Piştî sê caran şuştina bi TBST, şaneyên boyaxkirî li ser mîkroskopa berevajîkirî ya Nikon Eclipse Ti-E hatin çavdêrîkirin. Wêne bi kameraya CCD ya Hamamatsu ORCA-R2 ya sarbûyî bi karanîna nermalava MetaMorph (Molecular Devices) hatin kişandin.
Dema şandinê: 17ê Hezîrana 2024an